七葉皂苷鈉微乳注射劑的安全性及藥效學研究

覃瑤，陽勇，龔曉麗，李紫薇，趙嘉將，羅維早*

(1.太極集團有限公司，重慶 401147；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065；3.四川省中醫藥科學院中醫研究所，成都 610041；4.重慶醫科大學，重慶 400016)

·論 著·

七葉皂苷鈉微乳注射劑的安全性及藥效學研究

覃瑤1,2，陽勇2，龔曉麗3，李紫薇4，趙嘉將1，羅維早1,2*

(1.太極集團有限公司，重慶 401147；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065；3.四川省中醫藥科學院中醫研究所，成都 610041；4.重慶醫科大學，重慶 400016)

目的 對市售七葉皂苷鈉粉針及自制七葉皂苷鈉微乳注射劑的安全性和療效進行對比研究。方法 以新西蘭家兔為試驗用動物，進行溶血試驗和血管刺激性試驗，對用藥安全性進行考察；對二甲苯致小鼠耳腫脹及耳廓毛細血管通透性增加的抑制作用進行考察，作出初步藥效學評價。結果 市售粉針和自制微乳劑均有輕微的溶血和一定的刺激性，組間無明顯差別；高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及微乳注射劑對二甲苯所致小鼠耳腫脹及耳廓毛細血管通透性增加均有明顯的拮抗作用，其中七葉皂苷鈉微乳注射劑的拮抗作用更為明顯。結論 市售粉針劑和自制微乳注射劑均存在一定的靜脈注射安全性風險，兩者抗炎消腫作用明顯，七葉皂苷微乳注射劑療效更為顯著。

注射用七葉皂苷鈉；微乳劑；安全性；有效性

七葉皂苷鈉為七葉樹科植物天師栗的干燥成熟果實(娑羅子)提取得到的皂苷鈉鹽，主要成分是七葉皂苷，屬于三萜皂苷類藥物[1]。七葉皂苷不溶于水，其鈉鹽具有很好的水溶性。七葉皂苷鈉具有顯著的抗炎消腫功能，臨床用于多種疾病的治療。市售劑型主要有片劑、粉針劑、凝膠劑，其中七葉皂苷鈉粉針應用最為廣泛，但其靜脈給藥對血管刺激性大，可致靜脈疼痛和靜脈炎[2]。微乳是一種新型理想的藥物釋放載體，具有透明、穩定、吸收完善和靶向釋藥等特點，能夠提高藥物儲藏穩定性和生物利用度，并能提高療效。同時，微乳對炎癥病灶具有一定的趨向性，微乳的相關輔料已有注射用標準，使其新藥開發前景樂觀，臨床應用價值日益提高[3]。因此，本研究將七葉皂苷鈉在酸性條件下制備成注射用水包油型微乳劑型。在此條件下，七葉皂苷鈉游離為七葉皂苷，脂溶性顯著增加溶于油相，降低了水相中的含量，從而降低了與血管壁接觸的機會，減少對血管壁的刺激，增強患者用藥的安全性。同時借助微乳對炎癥病灶的趨向性，以期提高藥物在炎癥病灶的濃集，增加療效。

1 儀器與試藥

1.1 儀器設備

JB-2型恒溫磁力攪拌器(上海智光儀器儀表有限公司)；萬分之一電子分析天平(德國賽多利斯)；DT5-2型低速臺式離心機(北京時代北利離心機有限公司)；電子恒溫水浴鍋(北京中興偉業儀器有限公司)；BS224電子天平(北京賽多利斯儀器系統公司)；756PC紫外-可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；Allegra X-12離心機(美國貝爾曼庫爾特有限公司)；LDZM-50立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)。

1.2 供試品溶液

七葉皂苷鈉微乳注射劑(自制，2 mg·mL-1)；注射用七葉皂苷粉針(武漢愛民制藥有限公司，批號：1111078，規格：10 mg·瓶-1)；實驗時均用0.9%生理鹽水配制成適當濃度對動物尾靜脈注射給藥。

1.3 試劑

二甲苯(重慶川東化工集團有限公司，批號：20091020)；伊文思蘭(B.D.H進口分裝產品，實驗時用無菌生理鹽水配制成0.5%的溶液)；丙酮[重慶川東化工(集團)有限公司化學試劑廠，批號：20091118]；生理鹽水(重慶天圣制藥股份有限公司，批號：090804)。

1.4 動物

新西蘭家兔，普通級，體質量2.0～2.5 kg，♀♂各半，由四川省醫學實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：0044303；KM小鼠，♀♂各半，體質量18～22 g，由重慶市中藥研究院實驗動物中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(渝)20070006。

2 方法和結果

2.1 溶血試驗

取新西蘭家兔，耳緣靜脈取血約15 mL，用玻棒輕輕攪動血液以除纖維蛋白原，使成脫纖血液[4]。加入生理鹽水約10倍量，搖勻，2 000 r·min-1離心10 min，除去上清液，沉淀的紅細胞再用生理鹽水按上述方法洗滌3～4次，直至上清液不顯紅色為止，按所得紅細胞容積用生理鹽水配成2%兔血紅細胞混懸液，備用。取潔凈試管7支，1～5號管為供試品，按表1依次加入2%兔血紅細胞混懸液、生理鹽水、注射用七葉皂苷鈉微乳注射劑(5 mL溶于生理鹽水125 mL)、七葉皂苷鈉粉針液(5 mg溶于生理鹽水250 mL)；6號管為陰性對照；7號管為陽性對照?；靹騦～7號管，置(37±0.5)℃恒溫水浴箱中溫育。3 h后觀察溶血與凝集現象，按表2判斷是否溶血，結果見表3。

表1 注射用七葉皂苷鈉微乳溶血試驗加樣表Tab 1 The sample loading amount of hemolysis test about sodium aescinat micro-emulsion injection

表2 溶血試驗判斷標準Tab 2 Judging criteria of hemolysis test

表3 注射用七葉皂苷鈉微乳溶血試驗結果Tab 3 Hemolysis results of sodium aescinat micro-emulsion injection

結果表明，7號陽性對照管液體澄明鮮紅色，管底幾乎無紅細胞殘留，為全溶血；6號陰性對照管上層液無色澄明，紅細胞逐漸沉于管底，顏色呈鮮紅色，輕輕振搖后管底沉積的紅細胞均能完全分散，為無溶血；兔血紅細胞的1～4號各濃度七葉皂苷鈉微乳供試管、5號七葉皂苷鈉粉針供試管上層溶液呈澄明紅色，管底有少量紅細胞殘留，輕搖后紅細胞不能完全分散，表明部分溶血[5]。但注射用七葉皂苷鈉微乳與七葉皂苷鈉粉針供試管比較，無明顯差別。

2.2 血管刺激性試驗

取新西蘭家兔6只，隨機分成2組。第1組按0.6 mg·kg-1家兔右耳注射七葉皂苷鈉粉針注射劑(5 mg溶于生理鹽水10 mL)；第2組注射等給藥體積的生理鹽水作自身陰性對照，2組分別左耳緣靜脈注射七葉皂苷鈉微乳注射劑(5 mL溶于生理鹽水20 mL)。每天1次，連續給藥5 d，肉眼觀察注射部位及周圍組織是否有紅腫、充血等刺激現象。末次給藥后24 h，于注射部位及周圍組織處拔毛，75%乙醇消毒，恢復3 h以上。按30 mg·kg-1注射戊巴比妥鈉局部麻醉，沿注射部位1 cm開始取0.5 cm組織，取多段，各間隔1 cm，生理鹽水沖洗，用10%中性福爾馬林液固定24 h。常規脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下組織學檢查并比較[6]。結果見圖1。

圖1 血管刺激性試驗病理圖片A-生理鹽水；B-七葉皂苷鈉粉針；C-注射用七葉皂苷鈉微乳Fig 1 Pathology photos of vascular stimulation test A-saline; B-sodium aescinat powder injection; C-sodium aescinat micro-emulsion injection

圖1 結果表明，注射生理鹽水組，3只家兔耳緣靜脈無明顯充血，血管內皮細胞結構完整，無腫脹、變性、壞死及增生，管壁及周圍組織無炎癥改變。耳廓皮膚表面復層鱗狀上皮結構完整，上皮細胞無水腫、變性、壞死、增生及萎縮性改變，無炎癥及潰瘍形成。深層毛囊、皮脂腺及汗腺組織無特殊病變。中心部位彈性軟骨形態正常，軟骨細胞、軟骨基質及軟骨膜結構和染色反應正常。耳廓間質纖維組織無增生及變性，無急性及慢性炎癥改變[7]。

七葉皂苷鈉粉針組的3只家兔耳緣靜脈充血明顯，血管內皮細胞輕度腫脹，管壁周圍組織有出血以及炎性細胞浸潤。耳廓皮膚表面復層鱗狀上皮結構完整，上皮細胞無水腫、變性、壞死、增生及萎縮性改變，無炎癥及潰瘍形成。深層毛囊、皮脂腺及汗腺組織無特殊病變。中心部位彈性軟骨形態正常，軟骨細胞、軟骨基質及軟骨膜結構和染色反應正常。耳廓間質纖維組織無增生及變性，無急性及慢性炎癥改變。

注射用七葉皂苷鈉微乳注射的3只家兔的耳緣靜脈充血，血管內皮細胞輕度腫脹，管壁周圍組織有出血以及炎性細胞浸潤。耳廓皮膚表面復層鱗狀上皮結構完整，上皮細胞無水腫、變性、壞死、增生及萎縮性改變，無炎癥及潰瘍形成。深層毛囊、皮脂腺及汗腺組織無特殊病變。中心部位彈性軟骨形態正常，軟骨細胞、軟骨基質及軟骨膜結構和染色反應正常。耳廓間質纖維組織無增生及變性。與生理鹽水對照組比較，有顯著的病理組織學差異。

2.3 對二甲苯致耳腫脹的抑制作用

對小鼠耳腫脹模型靜脈注射給藥，有效劑量擬定為0.9 mg·kg-1(低劑量組)、4.5 mg·kg-1(高劑量組)。將50只小鼠按體質量隨機分為陰性對照組、七葉皂苷鈉粉針組和七葉皂苷鈉微乳注射劑組，每組10只。小鼠適應性飼養后，七葉皂苷鈉微乳注射劑組及七葉皂苷鈉粉針組均分別按劑量靜脈注射給藥，陰性對照組靜脈注射0.2 mL生理鹽水。給藥后30 min，在每鼠右耳涂上二甲苯(0.03 mL·只-1)。15 min后處死動物，用直徑為0.6 cm的打孔器在相同位置取兩耳片稱重，以兩耳片之差為腫脹度[8]。結果見表4。

表4 對二甲苯致耳腫脹的抑制作用(n=10)Tab 4 Inhibitory effect on xylene-induced mouse ear edema (n=10)

結果表明，與陰性對照組比較，高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及注射用七葉皂苷鈉微乳對二甲苯致小鼠耳腫脹均有明顯的抑制作用；其中七葉皂苷鈉微乳的效果更為明顯。

2.4 對二甲苯致毛細血管通透性增加的拮抗作用選50只健康小鼠進行實驗，按“2.3”項下進行動物分組、劑量設計，小鼠適應性飼養后，注射用七葉皂苷鈉微乳組及陽七葉皂苷鈉粉針組均分別按劑量靜脈注射給藥，陰性對照組靜脈注射0.2 mL生理鹽水。給藥后30 min，每只動物尾靜脈注射0.2 mL 0.5%伊文思藍生理鹽水溶液，立即在每鼠右耳涂二甲苯(0.03 mL·只-1)。15 min后處死動物，用直徑為0.6 cm的打孔器在相同位置取右耳片，剪碎，置盛有4 mL丙酮：生理鹽水(7∶3)的有塞試管內，浸泡96 h。離心，傾出上清液于590 nm比色，以吸光度值進行統計，結果見表5。

表5 對二甲苯致毛細血管通透性增加的拮抗作用(n=10)Tab 5 The antagonism on xylene-induced capillary permeability-increasing(n=10)

結果表明，當二甲苯涂小鼠右耳，因刺激作用導致毛細血管通透性增加，吸光度和毛細血管通透性成正比。與陰性對照組相比，高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及七葉皂苷鈉微乳注射劑對二甲苯引起的小鼠耳廓毛細血管通透性增加均有明顯的拮抗作用。七葉皂苷鈉微乳注射劑的拮抗作用更為明顯。

3 討論

3.1 安全性

實驗結果表明七葉皂苷鈉微乳注射劑和七葉皂苷鈉粉針注射劑家兔靜脈給藥有部分溶血和血紅細胞凝聚反應，且有血管刺激性反應，七葉皂苷微乳注射劑的充血現象略弱于七葉皂苷粉針劑，但無顯著差異，提示該藥物本身靜脈注射給藥存在一定風險性，還需要進一步的實驗研究七葉皂苷鈉引起溶血和血管刺激性反應的原因。

3.2 有效性

實驗結果表明高、低劑量的七葉皂苷鈉粉針及七葉皂苷鈉微乳注射劑對二甲苯致小鼠耳腫脹及耳廓毛細血管通透性增加均有明顯的抑制作用，其中七葉皂苷鈉微乳的效果更為明顯，為后續研究提供了一定的基礎。粉針組與微乳注射劑間無顯著性差異，其原因可能在于七葉皂苷鈉自身的抗炎效果較為明顯，故其組間差異難以分析。

本次對七葉皂苷鈉粉針劑和微乳注射劑的安全性及藥效學的對比研究中，市售粉針和自制微乳劑均有輕微的溶血和一定的刺激性。溶血和刺激性可能還源于主藥七葉皂苷鈉本身，也可能源于微乳劑中的乳化劑和助乳化劑等輔料[9]，其注射用安全性還有待進一步的考察。自制微乳劑較市售粉針劑有明顯的抗炎消腫作用，可能是選用有雙親性的微乳作為藥物載體，避免了藥物與血管壁的直接接觸，增加了藥物在炎癥部位的富集，從而使其抗炎消腫作用增強[10]?？偠灾?，微乳作為一種新型藥物載體，穩定、吸收迅速完全、能增強療效，如能降低其不良反應，其制劑有很大潛力。隨著研究的深入，微乳中藥制劑將有更廣闊的發展前景。

REFERENCES

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Study on the Safety and Pharmacodynamics of Sodium Aescinat Micro-emulsion Injection

QIN Yao1,2, YANG Yong2, GONG Xiaoli3, LI Ziwei4, ZHAO Jiajiang1, LUO Weizao1,2*
(1.Taiji Group, Chongqing 401147, China; 2.Chongqing Institute of Traditional Chinese Medicine, Chongqing 400065, China; 3.Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences, Chengdu 610041, China; 4.Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China)

OBJECTIVE To undertake a contrastive study on safety and pharmacodynamics of sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection. METHODS New Zealand rabbits were chosen as experimental animals for hemolysis and vascular stimulation tests, and its safety for therapy was probed. Investigate the inhibitory effect on xylene-induced mouse ear edema and capillary permeability-increasing, and a preliminary pharmacodynamics evaluation was made. RESULTS Both of sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection had slight hemolysis and stimulation, there was no evident difference between the two groups; both groups of high dose and low dose sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection had remarkable restrictive effect on mouse ear edema and capillary permeability-increasing, the antagonistic action of micro-emulsion injection was more apparent. CONCLUSION Both of sodium aescinat powder injection and micro-emulsion injection have a certain intravenous security risk, and they also have significant anti-inflammatory effects, the anti-inflammatory effects of sodium aescinat micro-emulsion injection is more apparent.

sodium aescinat for injection; micro-emulsion for injection; safety; validity

R965.3

A

1007-7693(2013)10-1043-04

2013-03-07

國家自然科學基金(81073062)；重慶市中藥產業“重構提升”行動科技攻關項目

覃瑤，女，博士 Tel: 13527482150 E-mail: trowa1982@126.com*

羅維早，男，研究員 Tel: 18623088135 E-mail: loweizao@163.com