水楊酸和牛血清白蛋白的相互作用研究及共存銅離子的影響

王旭，吳淑春，王家學，鄭青，郭玉華

(1.浙江醫學高等?？茖W校，杭州 310053；2.湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000)

水楊酸和牛血清白蛋白的相互作用研究及共存銅離子的影響

王旭1，吳淑春1，王家學1，鄭青2，郭玉華2

(1.浙江醫學高等?？茖W校，杭州 310053；2.湖州師范學院生命科學學院，浙江 湖州 313000)

目的 研究銅離子對水楊酸與血清白蛋白相互作用的影響。方法 采用熒光光譜技術研究了不同溫度下水楊酸與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用及銅離子對水楊酸-BSA體系的影響。結果 運用理論模型處理實驗數據，得到水楊酸與牛血清白蛋白(BSA)的猝滅常數、結合常數、結合力類型等相互作用參數。結論 銅離子存在時，不改變水楊酸對BSA內源熒光的猝滅類型和水楊酸-BSA分子間作用的類型，但使水楊酸與BSA的表觀結合常數增大。

水楊酸；牛血清白蛋白；銅離子；熒光光譜法

水楊酸是臨床常用藥物，有抗真菌和溶解角質等多效藥理活性。常用藥物“阿司匹林”即乙酰水楊酸，在生物體內能很快被轉化為水楊酸。血清白蛋白是血漿中最為豐富的蛋白質，能與多種內源或外源性物質結合，起到存儲與轉運的作用[1]。銅是生命體中所必須的微量元素，同時作為各種金屬酶的活性中心是生物體內載氧蛋白活性部位的基本成分[2-3]。藥物小分子與血清白蛋白之間的復合物通常是借助于分子間作用力而形成的超分子化合物，而體內的微量金屬元素既可能與藥物小分子形成配合物，也可能影響蛋白質-藥物超分子體系[4-5]。故從不同角度研究蛋白質-藥物之間及其在金屬離子存在情況下的結合反應，有助于了解藥物在體內的運輸和分布情況，對于闡明藥物的運輸、毒性、代謝過程及了解蛋白質的結構與功能關系具有重要意義。

因牛血清白蛋白(BSA)與人血清白蛋白高度同源，已被廣泛用作蛋白質模型化合物進行研究[6]。熒光光譜法是研究生物大分子，特別是蛋白質與各種有機小分子、離子和無機化合物相互作用的重要手段[2,7-8]。為了深入考察銅離子對水楊酸與蛋白質之間的相互作用的影響，本實驗用熒光光譜研究銅離子對水楊酸與牛血清白蛋白(BSA)相互作用的影響，運用理論模型處理實驗數據得到猝滅常數、結合常數、結合力類型等重要相互作用參數。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

FP-6200 型熒光分光光度計(日本Jasco公司)；Finnpipette移液器(上海雷勃分析儀器有限公司) 5～50 μL，20～200 μL；TB-85型超級恒溫器(日本Shimadzu公司)；UPWS-10T超純水器(杭州永潔達凈化科技有限公司)；AB265-S電子分析天平(瑞典METTER TOLEDO公司)。

BSA溶液：以0.05 mol?L-1、pH=7.4的Tris-HCl溶液配制，以0.10 mol?L-1NaCl維持離子強度，濃度為1.0×10-4mol?L-1。水楊酸溶液：以0.05 mol?L-1、pH=7.4的Tris-HCl溶液配制，濃度為1.0× 10-3mol?L-1。CuCl2溶液：以0.05 mol?L-1、pH=7.4的Tris-HCl溶液配制，濃度為1.0×10-3mol?L-1。

BSA為生化試劑，購于華東醫藥集團有限公司。水楊酸、三羥基氨基甲烷(Tris)(純度≥99.9%)、HCl(濃度為36%～8%)、NaCl(含量≥99%)、CuCl2(含量≥99%)均為分析純；實驗用水為超純水器處理的超純水。

1.2 實驗方法

BSA熒光激發和發射光譜的測定：移取一定量BSA溶液于石英比色皿中，設置發射波長為280 nm，狹縫寬度為5 nm，在室溫(298 K)下繪制250～350 nm的熒光激發光譜，測得其最大激發波長為282 nm；并在其最大激發波長處設置狹縫寬度為5 nm，在室溫(298 K)下繪制300～500 nm的熒光發射光譜，得到熒光發射光譜的最大發射波長為345 nm。

不同濃度水楊酸對BSA的熒光滴定：在一系列10.0 mL比色管中，準確移取2.0 mL BSA 溶液，用微量注射器加入不同體積的水楊酸溶液，加Tris-HCl溶液定容至10.0 mL，作用1 h后，在最大激發波長為282 nm處，在280～500 nm內掃描BSA的熒光發射光譜。

銅離子存在時不同濃度水楊酸對BSA的熒光滴定：在一系列10.0 mL比色管中，準確移取2.0 mL BSA溶液，用微量注射器加入200 μL的CuCl2溶液，用微量注射器加入不同體積的水楊酸溶液，加Tris-HCl溶液定容至10.0 mL，作用1 h后，在最大激發波長為282 m處，在280～500 nm內掃描BSA的熒光發射光譜。

2 結果與討論

2.1 熒光猝滅現象

蛋白質分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等氨基酸殘基在一定波長的紫外光激發下能夠發出熒光。因苯丙氨酸的熒光非常弱，所以熒光信號主要來自色氨酸和酪氨酸。故蛋白質的天然熒光及其變化直接反映了蛋白質中色氨酸、酪氨酸殘基本身和周圍環境的變化[9]。

在無Cu2+存在的情況下，隨著水楊酸濃度的不斷增加，BSA的內源熒光強度逐漸降低，但激發峰和發射峰的峰形基本不變，結果見圖1。Cu2+對水楊酸與牛血清白蛋白作用的熒光有協同猝滅作用，隨著水楊酸濃度的增加，BSA的內源熒光降低的強度更大，但激發峰和發射峰的峰形基本不變，結果見圖2。同時，圖1和圖2在409 nm左右均出現了一個熒光發射峰，且發射峰的強度隨著水楊酸濃度的增加而增強，這是溶液中游離的水楊酸產生的[10]。

圖1 水楊酸-BSA的熒光猝滅圖a→j-水楊酸濃度依次為：0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.5 mol·L-1Fig 1 Fluorescence quenching of salicylic acid-BSA a→j-the concentration of salicylic acid: 0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5 mol·L-1

圖2 水楊酸-BSA-Cu2+的熒光猝滅圖a→j-水楊酸濃度依次為：0，0.25，0.5，0.75，1.0，1.25，1.5，1.75，2.0，2.5 mol·L-1Fig 2 Fluorescence quenching of salicylic acid-BSA-Cu2+a→j-the concentration of salicylic acid: 0.0, 0.25, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.5 mol·L-1

2.2 猝滅機制

引起BSA熒光猝滅的原因可能是動態猝滅或靜態猝滅。前者是一種能量轉移或電子轉移過程，不影響蛋白質的結構和生理活性。后者則是由于發生了配合作用，通常是產生了不發熒光的配合物，對蛋白質的二級結構可產生影響，并可影響其生理活性。為了判斷水楊酸引起的BSA熒光猝滅是動態猝滅還是靜態淬滅，根據猝滅效率遵循的Stern-Volmer方程：

式中F0和F分別表示未加入和加入猝滅劑時的相對熒光強度，Ksv表示動態猝滅常數，Kq表示雙分子猝滅過程的速率常數，τ0為不存在猝滅劑分子時熒光分子的平均壽命(τ0=10-8s)，[Q]表示猝滅劑的濃度。作F0/F～[Q]關系圖，得到不同溫度下Ksv的值見表1。

表1 不同溫度下水楊酸與BSA的熒光猝滅常數Ksv及線性相關系數rTab 1 Quenching constants Ksv, correlation coefficient r of salicylic acid-BSA at different temperatures

由(1)式知Kq=Ksv/τ0，由表1中Ksv計算得Kq，Kq的數量級為1012，遠大于各類猝滅劑對生物大分子最大擴散碰撞猝滅速率常數2.0× 1010L·mol-1·s-1[11]，且Ksv隨著溫度的升高有所減小，由此斷定不管Cu2+存在與否，水楊酸對BSA的猝滅不是由于分子間碰撞引起的動態猝滅，而是由于形成不發光復合物的靜態猝滅。

從表1中水楊酸對BSA的猝滅常數Ksv可知，Cu2+存在時，對水楊酸與牛血清白蛋白作用的熒光有協同猝滅作用，能提高水楊酸與BSA的結合能力，猝滅常數Ksv比Cu2+不存在時大，表明Cu2+對BSA的內源熒光猝滅效應有所增強，Cu2+可能參與了BHA-BSA形成配合物的作用過程。

表2 不同溫度下水楊酸與牛血清白蛋白配合物的離解常數KD與結合常數KLBTab 2 Dissociation costants KDand binding constants KLBof salicylic acid-BSA at different temperatures

2.3 結合常數

在靜態猝滅中，結合常數KLB與熒光強度、猝滅劑濃度之間的關系可以用 Lineweaver-Burk雙倒數方程表示[8]：

金屬離子直接影響藥物與蛋白質的結合，不同金屬離子對不同藥物分子與蛋白質結合有截然不同的兩種影響：一是對藥物與蛋白質結合有減小作用[12-13]，二是對藥物與蛋白質的結合有增強作用[7-8]。一般認為，前者主要是由于金屬離子與蛋白質的作用，導致蛋白質與藥物結合的緊鄰區域構型發生改變，從而削弱了藥物與蛋白質的結合；后者則主要是由于金屬離子同時與藥物和蛋白質結合，在藥物和蛋白質分子間形成“離子架橋(metal ionbridge)”，從而起到增強作用。Cu2+的存在使BSA與水楊酸的結合常數略有增大，屬于第2種情況。這個過程中，Cu2+的參與降低了藥物小分子的游離濃度，這樣便增強了藥物與蛋白質的結合力，對延長藥物作用時間、減小藥物毒性的臨床治療是有效的。

2.4 水楊酸與BSA之間作用力的推測

一般情況下，藥物小分子與蛋白質大分子間的非共價相互作用屬分子間的弱相互作用，包括氫鍵、范德華力、靜電和疏水等多種相互作用形式，當溫度變化不大時，可將焓變視為常數。根據熱力學公式可計算藥物小分子與生物大分子結合過程的有關熱力學參數：

由熱力學參數可簡單判斷其結合作用類型[14]：若ΔH＞0及ΔS＞0，則主要表現為疏水作用；ΔH＜0及ΔS＞0主要表現為靜電作用；ΔH＜0及ΔS＜0主要表現為氫鍵或范德華力。根據實驗得到不同溫度下各體系的KLB值，由此求出其結合過程的熱力學參數，見表3。

表3 不同溫度下水楊酸-BSA作用過程的熱力學參數Tab 3 Thermodynamic parameters of salicylic acid-BSA at different temperatures

由實驗結果的熱力學參數顯示，有無Cu2+存在下，水楊酸與BSA結合過程均為ΔG＜0、ΔS＞0，表明其作用過程是一個熵增加，自由能減小以靜電引力為主的自發過程。但多數情況下，有機小分子與蛋白質的反應是多種作用力協同作用的結果。

3 結論

熒光光譜實驗表明，在水溶液中，由于水楊酸與BSA的結合而對BSA熒光產生了靜態猝滅作用；銅離子存在時，不改變水楊酸對BSA內源熒光的猝滅類型，但使水楊酸與BSA的表觀結合常數增大。有無Cu2+存在下，水楊酸與BSA結合過程均為ΔG＜0、ΔS＞0，表明其作用過程是一個熵增加，自由能減小以靜電引力為主的自發過程。

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Interaction of Salicylic Acid with Bovine Serum Albumin and the Effect of Coexistent Cu2+on the Reaction

WANG Xu1, WU Shuchun1, WANG Jiaxue1, ZHENG Qing2, GUO Yuhua2
(1.Zhejiang Medical College, Hangzhou 310053, China; 2.Faculty of Life Science, Huzhou Teachers College, Huzhou 313000, China)

OBJECTIVE To investigate the interactions of salicylic acid and bovine serum albumin (BSA) in the presence of Cu2+. METHODS The interaction between salicylic acid and BSA was investigated using fluorescence at different temperatures. The effect of Cu2+on the salicylic acid-BSA system was also researched. RESULTS The quenching constants, binding constants and binding force type were measured according to theory model. CONCLUSION The presence of Cu2+doesn’t change quenching type and force type between salicylic acid and BSA, but the apparent association constant(KLB) becomes higher.

salicylic acid; bovine serum albumin; Cu2+; fluorescence spectrometry

R913

A

1007-7693(2013)10-1066-05

2012-12-25

浙江省自然科學基金項目(LQ12B03001)；浙江醫學高等?？茖W校一般研究計劃項目(2013B04)

王旭，女，博士，副教授 Tel: (0571)87692890 E-mail: wangxu.linda@163.com