主動靶向脂質體研究進展

左勇亮，肖人鐘，王蓉蓉

(1.九江市婦幼保健院，江西 九江 332000；2.江西昂泰制藥有限公司，江西 九江 332300；3.浙江大學校

醫院，杭州 310009)

主動靶向脂質體研究進展

左勇亮1，肖人鐘2*，王蓉蓉3

(1.九江市婦幼保健院，江西 九江 332000；2.江西昂泰制藥有限公司，江西 九江 332300；3.浙江大學校

醫院，杭州 310009)

目的 介紹主動靶向脂質體最新研究進展。方法 查閱近年來國內外相關文獻，對主動靶向脂質體的表面修飾、配體選擇及應用進行總結和歸納。結果 主動靶向脂質體的表面修飾有3種方法：作為組份直接制備；鍵合到脂質體表面；后插入法。主動靶向脂質體可以將藥物傳遞到靶組織、靶向細胞或靶細胞器，提高藥物的生物利用度，而不增加對正常組織或細胞的毒性，是近年研究最為廣泛的主動靶向給藥系統。結論 主動靶向脂質體是一種非常有前途的給藥系統。

主動靶向脂質體；靶向給藥系統；配體

主動靶向給藥系統是指通過載體結構修飾或生物識別作用將藥物定向運送至病變部位發揮藥效，而不損傷周圍的正常細胞、組織和器官的體系[1]。脂質體是最常用的靶向給藥載體，其靶向性分為主動靶向和被動靶向，是由類細胞膜磷脂雙分子層組成的、內部為水相的封閉囊泡，現已廣泛應用于藥物制劑領域。脂質體作為主動靶向給藥載體具有許多優點，如：雙親性、生物相容性、容易表面修飾、不引起或只引起非常小的抗原性、致熱性、過敏性和毒性反應[2-3]。由于脂質體具有類細胞膜結構，所以可以通過吞噬、融合和吸附的方法進入靶細胞。動態的脂質體膜能更方便的吸附配體到脂質體表面，使配體在脂質體表面分布更為平均，與靶分子結合更為容易[4-5]?，F已有多篇論文對脂質體的制備進行了系統性綜述[6-7]，故本文不再介紹。本文將著重對主動靶向脂質體的表面修飾及應用進行簡要綜述。

1 主動靶向脂質體的表面修飾

通過利用配體修飾脂質體表面，能有效地增加靶向效率，精確地靶向靶細胞或靶組織，從而提高生物利用度。配體修飾脂質體的方法應該簡單、快速，形成的化學鍵應該穩定、沒有毒性，而且能高效地識別靶組織。配體修飾脂質體的方法分為非化學鍵合吸附和化學鍵耦合，前者由于具有吸附效率低、分布不均勻、不能保證配體在脂質體表面、配體易分離等，現在該方法應用較少[8]?；瘜W鍵耦合具有的優點是穩定性好、重復性好和分布均勻，所以該方法是脂質體表面修飾的常用方法?，F主要有3種方式制備配體修飾的脂質體，見圖1。

圖1 配體修飾脂質體的方法A-配體與脂質耦合后，作為制備脂質體的成分，直接制備；B-直接鍵合到脂質體表面；C-后插入法Fig 1 The strategies of adsorbing ligands onto the vector surface A-addition of ligands as components during the preparation liposomes; B-direct coupling method; C-post insertion method

①配體與脂質耦合后，作為制備脂質體的成分，直接制備。

Yan等[9]先將LyP-1配體與聚乙二醇-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)鏈接，然后將其與磷脂、膽固醇、PEG-DSPE一起作為脂質體組成成分，用薄膜水化法制備包封多比柔星的LyP-1-PEG-脂質體。結果該脂質體粒徑較小、分布均勻，能增加腫瘤細胞和轉移性腫瘤淋巴結對載藥脂質體的吸收，從而能有效地抑制腫瘤細胞的增殖和腫瘤的轉移。

②直接鍵合到脂質體表面。首先制備表面含活性基團的含藥脂質體，然后配體與之反應形成主動靶向脂質體，但要求該反應條件溫和、效率高。常用的活性基團有酰肼基、馬來酰亞胺基、羧基等[10-11]。

Maruyama等[10]先制備了表面含羧基的PEG-脂質體(HOOC-PEG-脂質體)，然后加入一種單克隆抗體-34A，使之與羧基反應，形成34A-PEG-脂質體。用普通脂質體和PEG-脂質體作為對照，發現34A-PEG-脂質體與肺的結合率比普通脂質體高1.3倍。表明34A-PEG-脂質體沒有空間立體阻礙，未鏈接抗體的PEG能有效的避免被網狀內皮系統(RES)吸附，增加34A-PEG-脂質體的血藥濃度和體循環時間。

③后插入法。

先制備載藥脂質體，然后把配體-脂質通過孵育法插入到載藥脂質體表面。利用后插入法能插入多種配體，實現個性化治療[12]。

Kullberg等[13]先制備了包封DNA復合物和吖啶的脂質體，然后在60 ℃，孵育1 h，插入表皮生長因子(EGF)-PEG-DSPE。結果每個脂質體微球表面含有10～15個EGF分子，對人神經膠質腫瘤細胞表面的EGF受體有特殊的親和作用。Allen等[12]證實后插入法能應用于抗體、抗體碎片、多肽配體，允許多種配體插入到已制備好的載多種藥物的脂質體，有利于實現個性化治療。后插入法制備靶向脂質體操作簡單、快速、柔韌性好，可以應用于實驗研究和工業化。

目前配體修飾的靶向脂質體的制備最常用的方法是配體與脂質耦合后，作為制備脂質體的脂質成分，直接制備，但該方法會造成分布不均，而且配體在脂質雙層膜的內外均有分布，降低了配體靶向效率。另一種方法是直接鍵合到脂質體表面，但這一方法的反應效率往往不高也不確定。后插入法體操作簡單、快速、柔韌性好，能確保配體在脂質體表面，而且分布均勻，但有可能降低藥物包封率。因此，脂質體的表面修飾需要根據不同的藥物、不同的工藝，選擇合適的修飾方法。

2 配體的選擇

靶向配體是影響主動靶向脂質體靶向效率重要因素之一，合適的靶向配體能極大的增加靶向效率，提高藥物的生物利用度。靶向配體的選擇原則：①靶向配體對細胞表面抗體或受體具有高度特異性、專一靶向性；②靶細胞表面的抗原或受體應該具有高濃度，靶細胞抗原反應不應該顯示高異質性；③在完成靶治療之前，抗體或受體不應降低或流出，而完成后靶向配體或復合物應能被快速的清除[14]。目前，研究者發現了許多靶向配體，并對其進行了深入的研究，如抗體、生長因子類、細胞因子類、蛋白質、核酸等[15-16]。這些配體可以分為非抗體靶向配體和抗體靶向配體。

2.1 非抗體靶向配體

由于細胞周圍微環境的改變，一些細胞或者組織過度表達一些特殊的受體，而正常細胞低水平表達或不表達這些受體，因此可以在脂質體表面鏈接一些特殊的靶向配體靶向這些細胞或組織，傳遞藥物到靶細胞或組織。Gabizon等[17]實驗表明非葉酸修飾的脂質體僅局限于分布在細胞外液和巨噬細胞，而葉酸修飾的脂質體能將藥物傳遞腫瘤細胞內，增加了抗腫瘤效果。

非抗體靶向配體一般較易獲得、廉價、易處理，但選擇特異性較差。常見的非抗體靶向配體見表1。

表1 非抗體靶向配體Tab 1 Nonantibody targeting ligands

2.2 抗體靶向配體

非抗體靶向配體通常是通用的、低價的、易于獲得的，而其不良反應多源于特異性不強產生的表達[14]。如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸三肽(RGD)靶向細胞黏附分子，葉酸和轉鐵蛋白靶向生長因子受體，因此會結合一些非靶組織，降低靶向效率，產生不良反應。例如：葉酸存在于食物和人體中，血液中的游離葉酸會與脂質體表面的葉酸競爭結合靶組織[14]。

隨著抗體工程技術和噬菌體展示技術的發展，人們能獲得高靶向性、高親和力、低分子量的抗體或抗體碎片[22]，特別是用雜交瘤技術和DNA重組技術獲得人源化抗體，極大地降低了抗體的免疫源性[23]，從而極大地促進了抗體介導的靶向治療的研究。例如，anti-CD22單克隆抗體能與非霍奇金淋巴瘤細胞表面的CD22抗原進行特異性結合，因此O’donnell等[24]制備了anti-CD22-脂質體包封多比柔星(anti-CD22-LPD)。免疫熒光染色法檢測發現anti-CD22-LPD與表達CD22的細胞專一性結合，anti-CD22-LPD比普通脂質體對CD22陽性細胞具有更高的細胞毒性，但沒有增加殺死CD22陰性細胞的能力。Lopes de Menezes等[25]制備了anti-CD19單克隆抗體修飾的多比柔星脂質體(anti-CD19-LPD)抑制惡性B淋巴細胞。結果anti-CD19-LPD與CD19陽性B淋巴細胞結合率是非靶向脂質體的3倍。非靶向脂質體對B淋巴細胞或T淋巴細胞明顯具有更低的識別能力。

吳愛國等[26]使用胃蛋白酶在Tastuzumab抗體J鏈Fc段側切斷抗體獲得抗體F(ab')2段，并用抗體交聯法制備Trastuzmab F(ab')2段修飾的紫杉醇免疫脂質體。結果在相同時間內，大腸癌細胞HT-29對紫杉醇免疫脂質體的攝取要明顯高于對照組。Trastuzmab F(ab')2修飾的紫杉醇免疫脂質體對大腸癌細胞HT-29的殺傷作用強于對照組，且該作用具有時間依賴性。

3 主動靶向脂質體的應用

主動靶向脂質體能應用于傳遞各種藥物，脂溶性藥物能吸附或鑲嵌在雙分子層，水溶性藥物被包封于脂質體內部的水相，特別是能傳遞蛋白質、核酸，而不影響藥物的生物活性。

3.1 傳遞脂溶性藥物

脂溶性藥物制備成口服制劑的生物利用度較低，且波動性較大，而制備成注射劑需要加入大量的乙醇、吐溫等，刺激性很大，且具有毒性。周蔚等[27]構建了RGD修飾的紫杉醇長循環納米脂質體(RGD-SSL-PTX)，以紫杉醇注射液(商品名為泰素)為對照，尾靜脈注射肺腺癌細胞A549的荷瘤裸鼠。結果表明，RGD-SSL-PTX相比泰素有較好的長循環作用。RGD-SSL-PTX的腫瘤組織靶向效率較泰素有提高，而其他器官中藥物分布相對降低，最大耐受量也高于泰素，其抑瘤作用更明顯。還有，唐勇等[28]采用硫酸銨梯度法制備了半乳糖化紫杉醇長循環納米脂質體，延長了藥物在體內的循環時間，提高了腫瘤組織靶向效率而其他器官中藥物分布相對降低。從而改善了紫杉醇傳統劑型的藥物動力學和組織分布，提高了紫杉醇在體內的安全性和抑瘤作用。

Xiong等[29]制備了RGD修飾的立體穩定性脂質體(RGD-PEG-LP)包封脂溶性抗癌藥多比柔星，并證明RGD-PEG-LP增加了黑色素瘤細胞對多比柔星的胞內吸收，提高了抗腫瘤活性。RGD-PEG-LP能被動積聚在腫瘤組織和通過整聯蛋白介導的胞吞作用主動靶向腫瘤組織。

陳瑩等[30]將白介素-2(IL-2)直接鍵合到5-氟尿苷棕櫚酸酯(5-FURP)脂質體表面，研究其主動靶向IL-2受體高表達的腫瘤細胞的能力。結果脂質體具有緩釋作用，IL-2-5-FURP-脂質體呈劑量依賴性抑制腫瘤細胞的生長，對Hut-102的殺傷作用明顯優于5-FURP-脂質體及5-FURP。

3.2 傳遞水溶性藥物

大部分藥物因其水溶性或分子質量超過500 Da無法透過血腦屏障，而主動靶向脂質體能傳遞水溶性脂質體透過血腦屏障，從而提高腦內藥物濃度，降低不良反應。

閆穎等[31]以水溶性葡萄糖為模型，制備了葉酸受體為靶向的陽離子脂質體，流式細胞技術檢測KB細胞和HepG2細胞對葉酸靶向脂質體的攝取，結果表明葉酸受體靶向的長循環陽離子脂質體能提高細胞對脂質體的攝取。

呂清等[32]制備了轉鐵蛋白、葉酸共同修飾的阿霉素脂質體，結果該雙配脂質體在bEnd3細胞中攝取遠大于普通脂質體，藥物透過血腦屏障的速率顯著提高，并對下層C6細胞的毒性大大增加。

葉果等[33]研究表明，主動靶向脂質體對多藥耐藥有一定的逆轉作用。MRK-16修飾阿霉素免疫脂質體的多藥耐藥逆轉指數達7.45，逆轉指數4.28。

3.3 傳遞蛋白質和核酸

隨著生物技術、蛋白質工程技術的發展，大量的生物分子被用于疾病的治療，如蛋白質、核酸等，然而這些大分子通常被限制進入細胞和易被溶酶體降解，很難達到細胞質和細胞核。通過包封生物分子到主動靶向脂質體載體內，然后利用胞吞作用將其攝入，再在胞內釋放藥物，能防止被溶酶體降解，靶向病態的部位和提高靶細胞的吸收，從而提高這些不穩定的大分子藥物的治療[34]。

Gao等[35]構建了HER2重組人源化片段修飾的PEG-脂質體(HER2-PEG-LP)載siRNA藥物(anti-RhoA siRNA)。以RhoA作為抗癌藥物靶標，發現含2.5%PEG的HER2-PEG-LP能被SK-BR3細胞識別，并被內化，在細胞內釋放anti-RhoA siRNA能使RhoA表達沉默和阻止侵入細胞。

Falco等[36]用魚病毒性出血性敗血癥棒狀病毒(VHSV)的表面糖蛋白G修飾脂質體運載蜂毒肽，體外結果顯示該制劑能抑制VHSV的傳染性，95.2%的病毒直接失活。在感染后的不同時間加入該制劑，分析感染疫源地大小，發現VHSV的傳染性均受到抑制，減少了VHSV蔓延，并殺死了原生質膜能過度表達表面糖蛋白G的細胞。

總之，主動靶向脂質體傳遞藥物能避免生理學和生物學障礙，還能主動靶向靶組織或細胞，是熱門的新型載體，尤其適合應用于抗腫瘤藥物。雖然靶向配體的消除方式，還沒有闡明，有些配體分子量較大，靶向效率不高，但是隨著新材料的合成，新靶標和新配體的發現，將使主動靶向脂質體向更為安全、有效的方向發展，未來具有廣闊的應用前景。

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Advances in Active Targeting Liposomes

ZUO Yongliang1, XIAO Renzhong2*, WANG Rongrong3
(1.Jiujiang Maternity and Child Health Care Hospital, Jiujiang 332000, China; 2.Jiangxi Angtai Pharmaceutical Co., Ltd, Jiujiang 332300, China; 3.Campus Hospital of Zhejiang University, Hangzhou 310009, China)

OBJECTIVE To introduce the latest researches about active targeting liposomes. METHODS Review the strategies of adsorbing ligands onto the vector surface, the selection of targeted ligands and the application of active targeting liposomes through searching and summarizing relevant literatures. RESULTS There were three strategies of adsorbing ligands onto the vector surface: addition of ligands as components during the preparation liposomes, direct coupling method, and post insertion method. Active targeting of liposomes could deliver the cargo to target cells, tissues and even the intracellular localization, which could improve the drug bioavailability and produced no increase in toxicity towards normal tissue or cells. The drug-delivery system had become one of the most widely study of targeting drug-deliver systems in recent years. CONCLUSION The active targeting liposomes is a very promising drug delivery system.

active targeting liposomes; targeting drug-deliver systems; ligand

R944

A

1007-7693(2013)10-1151-06

2012-10-29

左勇亮，男，藥師 Tel: 15879220142 E-mail: zyld-1@163.com*

肖人鐘，男，碩士，工程師 Tel: (0792)2760867 E-mail: jimmyhz@aliyun.com