咪唑-［1，2-b］噠嗪類mTOR 抑制劑的合成及抗腫瘤活性研究

翁怡然，高善云，楊振軍，張亮仁 ，張禮和

(北京大學 醫學部 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京100191)

惡性腫瘤因其難于早期發現、診斷和治療已成為嚴重威脅人類健康的常見病。作用于細胞內信號通路的關鍵靶點的小分子抑制劑是一類新型的抗腫瘤藥物。磷酸肌醇3-激酶PI3K/人雷帕霉素靶蛋白mTOR 信號通路成為近年來抗腫瘤藥物研究的熱點。

人雷帕霉素靶蛋白mTOR(mammalian target of rapamycin)是哺乳動物絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，由2549 個氨基酸組成，分子量289 kDa，屬PI3K 系列激酶PIKK 家族［1］。mTOR 在細胞內以兩種復合物形式存在，分別是mTORC1 和mTORC2［2］。mTORC1 的主要功能是調節蛋白質合成和細胞周期進程，而mTORC2 則在肌動蛋白細胞骨架組織和細胞存活方面發揮重要作用［3－4］。目前第一代mTOR 抑制劑雷帕霉素及其類似物，如坦西莫司(temsirolimus)、依維莫司(everolimus，RAD001)、ridaforolimus 分 別 于2007、2009、2005 年經FDA 批準用于腎癌和骨肉瘤的治療［5－6］，使得mTOR 成為被臨床證實的有效抗癌藥物靶點。但由于雷帕霉素只能作用在mTORC1，對mTORC2 作用不強，且臨床上僅對部分腫瘤有效(如腎癌、骨肉瘤)，因此選擇性的mTORC1/mTORC2 雙重抑制劑，即ATP 競爭性mTOR 抑制劑成為該信號通路的研究熱點［7－9］。目前小分子mTOR 抑制劑有AZD-2014、INK-128 處于臨床Ⅰ期研究，OSI-027 處于臨床Ⅱ期階段［6］。

Figure 1 The structure of WYE-687 and WYE-354

Yu 等［10－14］設計合成了一系列吡唑并嘧啶類mTOR 抑制劑(圖1)，如化合物WYE-687(IC50=0.007 μmol·L－1)、WYE-354(IC50=0.005 μmol·L－1)。該類化合物的構效關系研究表明:1)嗎啉及其衍生物可顯著提高吡唑并嘧啶類化合物與mTOR的結合能力，極大地提升了該類mTOR 抑制劑的活性和選擇性;2)在6 位芳基上引入脲類及酰胺類取代基團可大幅提升化合物的活性，IC50可達到亞納摩爾級別;3)在6 位為芳基脲類取代的同時，在1 位引入哌啶衍生物，可顯著提高化合物對mTOR 的選擇性抑制作用。

基于對mTOR 結構及其與抑制劑結合特征的分析，本研究利用骨架遷越及生物電子等排原理，并以化合物WYE-354 為模型化合物，設計了咪唑-［1，2-b］噠嗪類mTOR 抑制劑。目標化合物結構均經1H-NMR、13C-NMR 及HRMS 確證。合成路線見圖2。

目標化合物的合成共分5 步。第一步是母核的構建，將3-氨基-4-溴-6-氯噠嗪、1-(N-Boc-哌啶-4-基)溴乙醛在加熱條件下回流，得到咪唑并噠嗪母核;第二步是通過堿性條件下的親核取代反應，在母核8 位引入嗎啉類結構;第三步脫去哌啶N 原子上的Boc 保護基，連接所設計的一系列基團;第四步是通過Suzuki 偶聯反應在母核6 位引入苯胺結構;最后一步是在堿性條件下與相應的胺類化合物進行三光氣反應，得到一系列終產物。

Figure 2 The synthetic route to target compounds 13 -28

1 合成實驗

化合物的核磁共振數據由Bruker AVANCE III 400 MHz 核磁共振波譜儀測定，由MestReNova(Ver.6.1.0，Mestrelab Research S. L. )軟件處理;質譜數據(ESI-TOF)由QSTAR 液質聯用儀測定;高分辨質譜數據(ESI-TOF)由Bruker Apex IV FTMS 型傅立葉離子回旋變換質譜儀測定;熔點由毛細管法測定，溫度未經校正;薄層色譜硅膠板及柱色譜硅膠(200 ～300 目，300 ～400 目)購自上海上邦實業有限公司。所有溶劑、原料和試劑如無說明均為市售分析純。

1.1 8-溴-6-氯-3-(N-叔丁氧羰基-哌啶-4-基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(1)的合成

將3-氨基-4-溴-6-氯噠嗪0.5 g(2.4 mmol)和1-(N-叔丁氧羰基-哌啶-4-基)溴乙醛12 mmol 加入到5 mL 無水乙醇中，加熱回流24 h。過濾干燥得褐色固體0.64 g，置于裝有30 mL 乙醇的燒瓶中，加入碳酸鉀0.45 g、二碳酸二叔丁酯(Boc2O)0.7 g，室溫反應12 h。過濾，柱色譜分離得白色固體0.55 g，收率55%，mp 100 ～102 ℃。

1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.60(s，1H)，7.34(s，1H)，4.24(s，2H)，3.29(s，1H)，2.94(s，2H)，2.07(d，J=21.4 Hz，2H)，1.83 ～1.60(m，2H)，1.49(s，9H)。MS(ESI-TOF+)m/z:415.3［M +H］+。

1.2 8-(4-嗎啉基)-6-氯-3-(N-叔丁氧羰基-哌啶基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(2)的合成

將化合物1 0.58 g(1 mmol)溶解于9 mLN，N-二甲基甲酰胺中，滴加嗎啉0.13 mL(1.1 mmol)、三乙胺0.23 mL(1.1 mmol)，回流24 h。過濾，柱色譜分離得淡黃色固體0.5 g，收率81%，mp 130 ～132 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.29(s，1H)，6.06(s，1H)，4.23(s，2H)，4.14 ～3.65(m，8H)，3.27(s，1H)，2.94(s，2H)，2.20 ～2.01(m，2H)，1.64(d，J=11.6 Hz，2H)，1.53(d，J=34.2 Hz，9H)。MS(ESI-TOF+)m/z:422.3［M +H］+。

1.3 (S)-8-(3-甲基嗎啉基-4-基)-6-氯-3-(N-叔丁氧羰基-哌啶基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(3)的合成

方法同化合物2，只是將原料嗎啉改為(S)-3-甲基 嗎 啉，收 率75%，mp 140 ～142 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.28(s，1H)，6.02(s，1H)，5.22(s，1H)，4.45(s，1H)，4.27(dd，J=23.6，6.5 Hz，2H)，4.13 ～4.00(m，1H)，3.90(d，J=11.5 Hz，1H)，3.86 ～3.67(m，2H)，3.50(td，J=12.5，3.5 Hz，1H)，3.27(t，J=11.8 Hz，1H)，2.94(t，J=11.5 Hz，2H)，2.12(d，J=12.6 Hz，2H)，1.76 ～1.57(m，2H)，1.49(s，9H)，1.36(d，J=6.7 Hz，3H)。MS(ESI-TOF+)m/z:436.4［M +H］+。

1.4 3-(N-甲氧羰基-哌啶-4-基)-8-(4-嗎啉基)-6-氯-咪唑并［1，2-b］噠嗪(4)的合成

將化合物2 0.6 g(1.42 mmol)溶于3.5 mL二氯甲烷溶液中，冰浴下滴加三氟乙酸1.2 mL，室溫反應12 h。加2 mol·L－1碳酸鈉水溶液中和，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，旋干，得油狀物0.52 g。將上述油狀物加入到裝有8 mL 二氯甲烷的燒瓶中，冰浴下滴加三乙胺(0.45 mL，3.2 mmol)和氯甲酸甲酯(0.16 mL，1.9 mmol)，室溫反應12 h。飽和碳酸氫鈉溶液洗滌，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，柱色譜分離［V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=2∶1］得黃色固體0.42 g，收率65%，mp 132 ～134 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.29(s，1H)，6.08(s，1H)，4.25(dd，J=14.3，8.6 Hz，2H)，4.09 ～3.97(m，4H)，3.97 ～3.84(m，4H)，3.75(d，J=10.6 Hz，3H)，3.41 ～3.18(m，1H)，3.01(t，J=12.3 Hz，2H)，2.14(d，J=12.3 Hz，2H)，1.78 ～1.62 (m，2H)。MS(ESI-TOF+)m/z:380.4［M +H］+。

1.5 (S)-3-(N-甲氧羰基-哌啶-4-基)-8-(3-甲基嗎啉基-4-基)-6-氯-咪唑并［1，2-b］噠嗪(5)的合成

方法同化合物4，只是將原料化合物2 改為化合物3、氯甲酸甲酯改為甲磺酰氯，收率63%，mp 136 ～138 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.29(s，1H)，6.03(s，1H)，5.23(s，1H)，4.60 ～4.17(m，3H)，4.12 ～4.00(m，1H)，3.91(dd，J=11.5，2.8 Hz，1H)，3.86 ～3.65(m，5H)，3.51(td，J=12.6，3.8 Hz，1H)，3.30(ddd，J=11.9，7.7，3.5 Hz，1H)，3.00(d，J=11.5 Hz，2H)，2.15(d，J=12.3 Hz，2H)，1.67(s，2H)，1.37(d，J=6.8 Hz，3H)。MS(ESI-TOF+)m/z:394.4［M +H］+。

1.6 3-(N-甲磺?；?哌啶-4-基)-8-(4-嗎啉基)-6-氯-咪唑并［1，2-b］噠嗪(6)的合成

方法同化合物4，只是將原料氯甲酸甲酯改為甲磺酰氯，收率68%，mp 96 ～98 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.32(d，J=7.3 Hz，1H)，6.09(d，J=3.2 Hz，1H)，4.27 ～3.82(m，10H)，3.24(dd，J=9.5，6.0 Hz，1H)，3.03 ～2.76(m，5H)，2.27(d，J= 11.3 Hz，2H)，1.90(td，J=12.7，3.9 Hz，2H)。MS(ESI-TOF+)m/z:400.3［M +H］+。

1.7 (S)-3-(N-甲磺?；?哌啶-4 基)-8-(3-甲基嗎啉基-4 基)-6-氯-咪唑并［1，2-b］噠嗪(7)的合成

方法同化合物4，只是將原料化合物2 改為化合物3、氯甲酸甲酯改為甲磺酰氯，收率70%，

mp 98 ～100 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.32(s，1H)，6.04(s，1H)，5.26(s，1H)，4.49(s，1H)，4.07(dd，J=11.7，3.6 Hz，1H)，3.92(dd，J= 20.9，8.8 Hz，3H)，3.79 (dd，J= 27.6，7.2 Hz，2H)，3.52(d，J=3.7 Hz，1H)，3.25(s，1H)，2.99 ～2.87(m，2H)，2.85(s，3H)，2.27(d，J=12.6 Hz，2H)，1.97 ～1.80(m，2H)，1.37(d，J=6.8 Hz，3H)。MS(ESI-TOF+)m/z:414.4［M +H］+。

1.8 3-(N-甲氧羰基-哌啶-4-基)-8-(4-嗎啉基)-6-(2-氨基苯基-5-基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(8)的合成

將化合物4 0.2 g(0.53 mmol)、4-氨基苯硼酸頻哪醇酯0.1 g(0.76 mmol)、四三苯基膦鈀0.1 g(0.1 mmol)加入到11 mLN，N-二甲基甲酰胺中，加入2 mol·L－1碳酸鈉水溶液0.8 mL，氬氣保護，120 ℃下反應12 h。水洗，二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱色譜分離［V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=150∶1］，得淡黃色固體0.17 g(含雜質)。

1.9 (S)-3-(N-甲氧羰基-哌啶-4-基)-8-(3-甲基嗎啉基-4-基)-6-(2-氨基苯基-5-基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(9)的合成

方法同化合物8，只是將原料化合物4 改為化合物5，收率72%，mp 126 ～128 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.71(d，J=8.0 Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.77(d，J=7.6 Hz，2H)，6.37(s，1H)，3.88(dt，J=62.6，12.7 Hz，7H)，3.53(t，J=12.5 Hz，1H)，3.34(t，J=11.9 Hz，1H)，3.03 ～2.77(m，6H)，2.35(d，J=11.0 Hz，2H)，2.02 ～1.88(m，2H)，1.32(d，J=6.6 Hz，3H)。MS(ESITOF+)m/z:451.4［M +H］+。

1.10 3-(N-甲磺?；?哌啶-4-基)-8-(4-嗎啉基)-6-(2-氨基苯基-5-基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(10)的合成

方法同化合物8，只是將原料化合物4 改為化合物6，產物含雜質。

1.11 (S)-3-(N-甲磺?；?哌啶-4-基)-8-(3-甲基嗎啉基-4-基)-6-(2-氨基苯基-5-基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(11)的合成

方法同化合物8，只是將原料化合物4 改為化合物7，收率70%，mp 118 ～120 ℃。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ:7.71(d，J=8.0 Hz，2H)，7.31(s，1H)，6.77(d，J=7.6 Hz，2H)，6.37(s，1H)，3.88(dt，J=62.6，12.7 Hz，7H)，3.53(t，J=12.5 Hz，1H)，3.34(t，J=11.9 Hz，1H)，3.03 ～2.77(m，6H)，2.35(d，J=11.0 Hz，2H)，2.02 ～1.88(m，2H)，1.32(d，J=6.6 Hz，3H)。MS(ESITOF+)m/z:471.4［M +H］+。

1.12 3-(N-叔丁氧羰基-哌啶-4-基)-8-(4-嗎啉基)-6-(2-氨基苯基-5-基)-咪唑并［1，2-b］噠嗪(12)的合成

方法同化合物8，只是將原料化合物4 改為化合物2，產物含雜質。

1.13 目標化合物13 ～28 的合成通法

將化合物8 ～12(0.1 mmol)加入二氯甲烷1 mL 中，滴 加 三 乙 胺57 μL，加 入 三 光 氣(0.12 mmol)，室溫攪拌10 min。將上述混合液滴加至相應胺類(0.6 mmol)的二氯甲烷(1 mL)溶液中，室溫反應12 h。水洗，二氯甲烷萃取，干燥，硅膠柱色譜分離［V(二氯甲烷)∶V(甲醇)=50∶1］，得到目標化合物13 ～28。目標化合物的結構及理化及波譜數據見表1。

Table 1 Physical constants and spectra data of target compounds

Continued Table 1

2 抗腫瘤活性評價

2.1 目標化合物與mTOR 的對接

mTOR 結構由PI3Kγ(3IBE)同源模建得到，去除受體中的配體小分子，對蛋白加氫，賦CHARMm 力場，作為分子對接的受體。配體小分子賦力場。使用Gold 3.0.3 進行分子對接實驗，設定10 個對接構象，選取打分數值最高的結合模式，用PyMOL v 0.99 分析對接結果。

圖3 為化合物16 與mTOR 對接示意圖，對接結果證明，化合物16 能夠進入mTOR 的ATP競爭性作用口袋，并且嗎啉環上的氧原子與Val2240 有氫鍵作用，芳基脲的氧原子分別與Asp2198、Phe2358 形成氫鍵作用。

Figure 3 The schematic of compound 16 combined with mTOR active sites

2.2 對人癌細胞株的體外增殖抑制實驗

選取對mTOR 高表達的腫瘤細胞株:人肺癌細胞株A549、H460、人黑色素瘤細胞株A375、人乳腺癌細胞株MCF-7、人腦膠質瘤細胞株U87，采用SRB 法，以AZD8055 為陽性對照藥，測試化合物的體外抗細胞增殖活性。設定給藥時間為72 h，每個測試組至少設定3 個復孔，重復兩次實驗得平均IC50值。實驗結果見表2。

Table 2 The antitumor activity of target compounds in vitro

2.3 mTOR 激酶抑制實驗

mTOR 激酶抑制實驗由Invitrogen 公司完成，使用Z'-LYTE(r)測試方法。選取活性化合物16、27(對A549、H460、A375、MCF-7、U87 細胞增殖的平均IC50值為4.3 μmol·L－1和7.6 μmol·L－1)進行mTOR 激酶抑制實驗，初篩設定在10 μmol·L－1和1 μmol·L－1兩種濃度，結果見表3。

Table 3 The inhibition rate of compounds 16，27 against mTOR enzymatic activity

對于1 μmol·L－1的抑制率大于50% 的化合物16 進行IC50值的測試，結果表明，化合物16 對mTOR 激酶有一定的抑制作用，IC50為274 nmol·L－1。

3 討論

3.1 化學合成

化合物1 的合成分為兩步，第一步是關環反應，所得產物的哌啶環N 原子上的Boc 保護基被脫除，故需在第二步重新連接Boc 基。第一步的產物為鹽酸鹽，不溶于反應溶劑乙醇，作者起初采用的后處理方法是用飽和碳酸鈉溶液洗滌、二氯甲烷萃取、干燥、柱色譜分離，操作繁瑣。后對反應完成后析出的褐色固體進行結構鑒定，發現其中雜質含量很少，可適當減少溶劑用量，使產物充分析出，過濾干燥后直接進行下一步反應，操作更為簡便。

化合物8 的后處理，作者起初采用反應完成后直接旋干溶劑、柱色譜分離的方法，后發現下一步反應收率總是偏低，副產物較多，分析其原因，很可能是由于化合物8 中混有反應溶劑DMF，影響了其與三光氣的反應。因此，在反應后需先用水洗去DMF，再進行柱色譜分離。

3.2 活性測試

體外細胞增殖實驗結果表明，化合物能夠對A549、H460、A375、MCF-7 和U87 腫瘤細胞有不同程度的抑制作用，基于體外抗腫瘤活性結果發現:1)化合物的R3為吡啶基對提高活性有利;2)8 位為S-甲基嗎啉基的化合物活性優于嗎啉基取代的化合物，尤其是對肺癌細胞的抑制作用有明顯提高;3)R2為甲磺?；鶗r，因化合物溶解性下降，活性降低。mTOR 激酶抑制實驗表明，化合物16 對mTOR 有較強的抑制作用(IC50=247 nmol·L－1)。以上實驗結果，將作為進一步結構改造的依據。

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