苯并噻嗪酮類GSK-3β 非ATP 競爭型抑制劑的設計、合成與生物活性評價

鹿文博，張 鵬，黃 科，楚 勇，2* ，葉德泳*

(1. 復旦大學 藥學院 藥物化學教研室，上海201203;2. 中國科學院 上海藥物研究所新藥研究國家重點實驗室，上海201203)

糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)是一個多功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［1］，在哺乳動物中廣泛存在。它參與調節體內多種生理過程，通過磷酸化作用影響一系列的細胞功能，包括代謝、分化、增殖，還有細胞凋亡等［2－4］。研究表明，GSK-3β 抑制劑可應用于治療糖尿病、阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)、癌癥等多種復雜性疾病，尤其是在治療阿爾茨海默病方面。

人體大腦內GSK-3β 的分布很廣泛［5］，其高活性或高表達會導致微管相關蛋白—tau 蛋白的過度磷酸化［6］，過度磷酸化的tau 蛋白與微管結合能力降低，從而導致其從微管上脫落，在細胞內形成神經元纖維纏結，這也是AD 公認的發病機制之一。因此抑制GSK-3β 是治療AD 的一個很好的途徑。目前臨床上應用的藥物只能緩解AD的某些癥狀，而無法阻止AD 的發病。因此，研究新型的選擇性較好的GSK-3β 抑制劑在治療AD方面有著很好的應用前景。

過去20 年里，關于GSK-3β 抑制劑的報道已有很多，但是這些抑制劑大多是ATP 競爭型的。該類抑制劑作用于GSK-3β 的ATP 結合位點，體外活性一般較好(納摩爾級)。但是由于該ATP結合位點在500 多種激酶中具有高度的保守性，因而ATP 競爭型抑制劑的選擇性往往較差。當前，GSK-3β 非ATP 競爭型抑制劑的研究引起了人們越來越多的關注，正在成為一個新的研究熱點。該類抑制劑作用于GSK-3β 所特有的底物結合位點或變構位點，與ATP 競爭型抑制劑相比，該類抑制劑選擇性較好。

盡管目前已知的GSK-3β 非ATP 競爭型抑制劑還不多，而且體外酶抑制活性還不高，即使活性最好的TDZDs(thiadiazolidinones)類化合物IC50值也僅有2 ～10 μmol·L－1［7］，但其中一個化合物NP031112 已在歐洲臨床試驗ⅡB 期中用于治療AD，表明GSK-3β 非ATP 競爭型抑制劑具有開發研究的可能性。

作為一個與多種疾病相關的靶點，GSK-3β抑制劑的研究，尤其是非ATP 競爭型抑制劑，有著更好的開發和應用前景。一方面，非ATP 競爭型抑制劑選擇性較好，并且其活性還有很大的提升空間;另一方面，該類抑制劑的開發進展迅速，具有比較明確的應用前景。因此致力于此類抑制劑的開發，有望找到活性和選擇性都較好的治療相關疾病的藥物，尤其是在治療阿爾茨海默病方面。

1 目標化合物的設計及合成方法

Palomo 等［8］最近報道的一個GSK-3β 非ATP競爭型抑制劑VP 0.7(圖1，IC50=3 μmol·L－1)引起了作者極大的興趣。該化合物含有一個較長的疏水側鏈和一個特異性的母核，計算機模擬推測其可能作用于GSK-3β 的變構位點［8］。本課題組在前期活性篩選中發現了另外一個GSK-3β 非ATP競爭型抑制劑HZjb(圖1，IC50=100 μmol·L－1)，盡管活性不高，但結構比較新穎。該化合物含有的苯并噻嗪酮母核與VP 0.7 的母核結構非常相似，因此作者綜合兩個化合物的結構特點，運用分子雜交(molecular hybridization)的概念［9］，設計合成了一系列以苯并噻嗪酮為母核的化合物，以期找到活性較好、結構新穎的GSK-3β 非ATP 競爭抑制劑。另外，對于長疏水側鏈的設計，首先考慮引入單純的疏水側鏈，以驗證疏水側鏈的作用;然后考察側鏈的長度對活性的影響;最后對側鏈做初步的修飾。

Figure 1 The structures of VP 0.7，HZjb and target compounds

目標化合物的合成路線如圖2 所示:原料1在碳酸鉀的的作用下，經過氮烷基化反應得到化合物2a ～2d;然后在氫化鈉的作用下(氮氣保護)，經過?；磻玫交衔?a ～3d 及目標化合物3e;化合物3a ～3d 可不經分離純化，直接與水合肼發生肼解反應得到相應的酰肼4a ～4d;在縮合劑HOBT/EDCI 的作用下，酰肼化合物4a ～4d 與不同的有機酸在室溫下縮合即得到目標產物5a ～5u。

Figure 2 The synthetic route to the target compounds

Continued Figure 2

2 合成實驗

化合物熔點由上海精密科學儀器有限公司生產的SGWX －4 型熔點儀測定，溫度未經校正;質譜由Agilent 1100s 質譜儀測定;核磁共振譜由Bruker AMX －400 型核磁共振儀測定，TMS 為內標，工作頻率400 MHz。柱色譜用51 ～70 μm 硅膠由上海上邦實業有限公司生產;TLC 硅膠板由煙臺市芝罘黃務硅膠開發試驗廠生產。實驗所用溶劑均為化學純或分析純。

2.1 2a ～2d 的通用制備方法

5.0 g(30.3 mmol)化合物1 和12.5 g (90.9 mmol)碳酸鉀溶于250 mL 無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，攪拌下加入相應鹵代物36.3 mmol，室溫攪拌過夜，TLC 檢測原料1 基本消失，停止反應。加等體積的水，乙酸乙酯(200 mL ×3)萃取，合并有機層，飽和食鹽水洗滌3 次，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱色譜分離(石油醚-乙酸乙酯)，得微黃色晶體或油狀物2a ～2d，收率68% ～78%。

2.2 3a ～3e 的通用制備方法

將3.9 mmol 化合物2a ～2d 和質量分數60%的氫化鈉0.44 g(7.8 mmol)加入到100 mL三頸瓶中，氮氣保護，放置冰浴中攪拌下加入無水N，N-二甲基甲酰胺(DMF)100 mL，冰浴下繼續攪拌0.5 h，反應液由微黃色變為玫紅色，然后加入碳酸二甲酯(DMC)7.8 mmol，之后撤去冰浴，室溫下反應約5 h，停止反應。滴加飽和氯化銨水溶液除去未反應的氫化鈉，然后加等體積水，乙酸乙酯(100 mL ×3)萃取，合并有機層，飽和食鹽水洗滌3 次，無水硫酸鈉干燥，硅膠柱色譜分離(石油醚-乙酸乙酯)，得油狀物3a ～3e，收率55% ～78%。

2.3 4a ～4d 的通用制備方法

將3.2 mmol 中間體3a ～3d 溶于25 mL 甲醇中，然后加入質量分數85% 水合肼2.48 mL(64 mmol)，回流過夜。蒸干溶劑，適量甲醇洗滌，得白色固體4a ～4d，收率71% ～88%。

2.4 5a ～5u 的通用制備方法

將477.5 μmol 羧酸溶于10 mL 乙腈，然后加入1-羥基苯并三唑(HOBT)477.5 μmol，攪拌15 min 后依次加入1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)65 mg(477.5 μmol)、三乙胺(Et3N)110 μL(795 μmol)及中間體4a ～4d 100 mg(398 μmol)，室溫攪拌24 h。停止反應后，減壓蒸餾除去溶劑，殘留物用飽和碳酸鈉水溶液超聲洗滌，過濾，干燥后用乙腈洗滌，再干燥即得相應目標產物，收率10% ～80%(對于溶解度較好的產物則用石油醚-乙酸乙酯硅膠柱色譜分離)。

合成的22 個目標化合物的理化常數及波譜數據見表1。

Table 1 The yield，melting point，MS and NMR data of the target compounds

Continued Table 1

3 活性實驗

3.1 基于化學發光法的體外酶抑制活性測試

化合物的GSK-3β 抑制活性的測試是基于Baki 的Kinase-Glo 測試方法，用96 孔板在緩沖溶液中進行測試［10］:4 μL 不同濃度化合物的DMSO 溶液用14 μL 緩沖溶液稀釋，然后在每孔中加入2 μL(20 ng)酶溶液，之后再加入含有12.5 μmol·L－1底物和4 μmol·L－1ATP 的緩沖溶液。30 ℃下孵育30 min，然后用40 μL Kinase-Glo 試劑終止酶反應。10 min 后記錄其化學發光強度。根據ATP 總量和消耗ATP 量的比例計算出抑制活性?？瞻讓φ詹患踊衔?，其抑制活性為100%。IC50是與空白對照相比，降低酶活性50%時的化合物濃度。所有目標化合物的IC50值見表2 所示。

Table 2 GSK 3β inhibitory activities of target compounds

3.2 化合物作用模式

化合物的抑制作用模式通過酶動力學實驗確證，同樣基于化學發光法進行測試，測試化合物與ATP 的相關性時，待測化合物濃度選擇為其IC50的2 ～3 倍，同時保持酶底物GS-2(糖原合成酶-2)的濃度不變(6.25 μmol·L－1)，分別測試在不同ATP 濃度(0.5、2、4、8 μmol·L－1)下化合物的酶抑制活性，然后采用Lineweaver-Burk 作圖法，根據直線的相交點來確定化合物的作用類型。直線交于y軸，抑制劑為ATP 競爭型;直線交于x軸，則抑制劑為非ATP 競爭型。同理，在測試化合物和底物GS-2 的關系時，ATP 濃度保持不變(2 μmol·L－1)，而底物GS-2 的濃度分別為0.78、1.56、3.13、6.25 μmol·L－1。

活性最好的化合物5h 的酶動力學測試結果如圖3 所示(圖中v代表酶促反應速率)。研究表明5h 的抑制作用既不與ATP 競爭，也不與底物競爭，因此推測5h 可能與VP 0.7 一樣是作用于GSK-3β 的變構位點。

Figure 3 Kinetic data determined for the compound 5h

4 結果與討論

4.1 GSK 3β 體外酶抑制活性

本文首先在苯并噻嗪酮骨架2 位上引入一個與VP 0.7 相同的疏水側鏈(正十二?；?得到目標化合物3e，該化合物與HZjb 相比IC50明顯提高，達到了34.6 μmol·L－1，這初步表明長疏水側鏈對化合物活性具有比較重要的影響。

隨后，在化合物3e 中插入具有氫鍵給體和受體的酰肼基團，得到化合物5h，該化合物活性又提高了約3 倍，IC50達到了11.9 μmol·L－1。鑒于長疏水側鏈對活性的重要影響，本文還考察了疏水側鏈長度與化合物活性之間的相關性，以期找到最佳長度的側鏈。因此設計合成了化合物5a ～5j，側鏈長度在n=0 ～14。從活性數據可以看出，該類化合物的活性與疏水側鏈長度之間的確有一定的相關性，如圖4 所示，側鏈長度約為11，即n=10 時，化合物活性最好。

Figure 4 The relationship between the length of side chain and inhibitory activities

考慮到長烷基疏水側鏈的代謝不穩定性，因而以疏水芳雜環取代部分或全部疏水側鏈進行初步的優化，以改善化合物的代謝性質。以苯基取代疏水側鏈得到的化合物5k 活性消失，再增加一個芳雜環得到的化合物5l、5m 依然沒有活性。但是在5k 苯基對位引入正辛基得到的化合物5n活性與5k、5l 及5m 相比明顯提高，IC50值為25.9 μmol·L－1，這說明化合物側鏈的長度和柔性對活性的影響都很大?；衔?o 的取代基由對位變為鄰位得到的化合物5p 活性有所提高，說明活性化合物的疏水側鏈很可能是以彎曲折疊的方式作用于特定的疏水空腔?；衔?q 含有一個柔性較差的較長共軛側鏈，但沒有活性。將該側鏈的雙鍵還原之后增加了化合物的柔性，活性也明顯提高(IC50=72.0 μmol·L－1)，表明側鏈的柔性對化合物活性也有重要影響。

R1取代基對化合物活性也有一定影響。從活性數據可以看出，無論是較小的基團甲基取代(5t)，還是較大的基團芐基(5s)、正丁基(5u)取代，化合物活性都會有所下降，R1為乙基時化合物活性最好。

4.2 化合物的動力學作用模式

對于化合物5h，首先是考察化合物的抑制活性與ATP 濃度的關系:從其雙倒數圖(圖3A)可以看出各濃度直線相交于y軸之外，由此可知化合物5h 為非ATP 競爭型抑制劑，這符合作者的設計初衷。進一步考察化合物活性與酶底物GS-2 濃度的關系:從其雙倒數圖(圖3B)可以看出，各濃度直線相交于x軸，由此可知化合物5h 是非底物競爭型抑制劑，這剛好初步印證了作者最初的設計思路，即該類含有長鏈的化合物很有可能作用于ATP 結合位點和底物結合位點之外的特異性變構位點。

綜上所述，酶促動力學結果反映出5h 既不是作用于ATP 結合位點，也不是作用于底物結合位點，而是有可能作用于這二者之外的變構結合位點。但是這個推測有待進一步用計算化學方法和化學生物學方法驗證。2 位長脂烴取代的苯并噻嗪酮類化合物作為一類新的GSK-3β 非ATP 競爭型抑制劑，值得進一步研究與開發。

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