雌激素受體α36 亞型配體結合區的結構模建、優化及驗證

王 東，金宏威，劉振明 ，張亮仁

(北京大學 藥學院 天然藥物及仿生藥物國家重點實驗室，北京100191)

雌激素是一類重要的內分泌調節分子，在體內通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)作用，而與組織發育、生殖功能中的多種生理過程相關，是重要的內分泌調節分子［1］。已知的研究表明，雌激素與乳腺癌、卵巢癌、結腸癌等多種癌癥的發生與治療關系密切［2-6］。雌激素替代物、雌激素受體選擇性調節劑(selective estrogen receptor modulator，SERM)等可以調控雌激素功能的分子，在乳腺癌以及更年期后婦女骨質疏松的防治方面有著廣泛的應用，同時SERM 還具有一定的心血管保護能力［5-8］。目前已經有多個SERM上市或處于研究中，如他莫昔芬［5］、雷洛昔芬等［7］。

雌激素受體可以分為α、β 兩個亞型［9］，上市或處于研究中的SERM 主要通過分子量為66 kDa 的雌激素受體亞型ER-α66 發揮藥理作用。2005 年，王兆一教授課題組發現了一種新的雌激素受體亞型ER-α36［10］。該亞型與ER-α66在染色體上的編碼基因相同，但經過不同的mRNA 剪輯而形成了新的分子量為36 kDa 的受體蛋白。不同于主要分布于胞漿中的ER-α66，ER-α36 主要分布在細胞膜上［10-11］。已知研究結果表明，ER-α36 具有獨特的配體結合譜及配體響應機制［11］;它對目前已有的雌激素受體激動劑和拮抗劑均有響應，可快速激活ERK(extracellular signal-regulated kinase)信號通路，被認為介導了雌激素受體的非基因組快反應機制［11-13］。同時，ER-α36 可以通過非配體依賴的方式，抑制ERα66 和ER-β 的活性［11，14-15］。生理學研究發現，在ER-α66 陽性或者陰性的乳腺癌患者體內，都可以發現ER-α36［16］，已有研究結果表明，ER-α36也與子宮內膜癌、食道癌、白血病以及骨質疏松存在著密切關聯［17-19］。ER-α36 在SERMs 的耐藥性效應產生中也有重要影響［20］。

目前，已有針對ER-α36 的調控分子處于臨床Ⅱ期研究階段(進展未發表)，但這些分子在體內如何通過選擇性或者多靶點相互作用產生治療效果的分子機制有待進一步的研究。由于ERα36 的三維結構尚未被解析，制約了選擇性雌激素調控分子的深入研究。因此，對ER-α36 的模建、分析其蛋白結構特征以及配體結合特征、模擬其配體結合模式對ER-α36 作用機制的研究以及新配體設計有重要意義。

本研究工作希望通過同源模建方法，建立ER-α36 的配體結合區域(ligand binding domain，LBD)三維結構，并進一步對其結構特征以及與雌激素受體亞型ER-α66 之間的異同進行比較分析。由于已知的ER-α66 LBD 存在與激動劑和拮抗劑結合的兩種空間結構，本文將分別建立對應的ER-α36 LBD 同源模型。與此同時，將采用動力學模擬和分子對接分析方法對建立的受體-配體復合物模型進行進一步的優化與驗證。

1 材料與方法

1.1 同源模建

雌激素受體亞型ER-α36 的序列來自王兆一教授發表的論文［10］。由于本次模建的主要目標是探索ER-α36 的配體結合區域特征，參照已知的ER-α66 LBD 的晶體結構［21-22］，截取了ERα36 LBD 序列區域進行模建，包括Leu133 ～Gly284 共152 個氨基酸。

ER-α66 LBD 已解析得到的晶體結構較多，按配體作用分類，存在與激動劑和拮抗劑結合的兩大類晶體復合物結構。本文作者同時采用了激動劑雌二醇(17β-estradiol，E2)復合物(PDB 編碼:1ERE)［21］，以及拮抗劑4-羥基-他莫昔芬(4-hydroxy-tamoxifen，OHT)復合物(PDB 編碼:3ERT)［22］作為同源模建的模板。兩個模板均用Discovery Studio 中的Clean Protein 功能修補了殘缺氨基酸，1ERE 模板中缺失的Leu462 ～Ser464 段不在對比序列范圍內，Tyr331 ～Pro336最近處與結合口袋距離超過1.3 nm，且本身為無規則卷曲，因而由建模程序自行優化最終模型中該段氨基酸結構。

序列比對工作采用Discovery Studio 2.5 軟件包完成［23］。由于ER-α36 與ER-α66 的高度同源性，采用手動的方法對齊了兩個受體序列中的對應氨基酸殘基。ER-α36 C 端的26 個氨基酸Ile285 ～Val310 無法對齊到可用的模板，且該段氨基酸對138 個氨基酸缺失已經形成的結構改變影響較小，故被排除在模建結構以外，詳細討論見結果與討論部分。同源模建通過Discovery Studio軟件包中的Build Homology Model 模塊完成。優化參數“Optimization Level”設置為High，禁止軟件自動優化Loop 區。分別針對激動劑和拮抗劑結合生成5 個同源模建模型，取DOPE(discrete optimized protein energy)分數［24］絕對值最大的模型，進行下一步的配體-受體復合物動力學優化研究。

1.2 分子動力學優化

以同源模建得到的雌激素受體亞型ER-α36的三維結構為基礎，使用Gromacs 3.3.3 分子動力學模擬軟件包［25］對結構模型進行進一步的優化處理。以Discovery Studio 軟件包完成分子坐標疊合操作。配體的構象優化以及電荷分布的計算采用Gaussian 09 程序完成［26］，其結果用于建立配體的Gromos96 力場參數［27］。PRODRG Server v 2.5 beta［28］用來生成配體力場的拓撲文件。

配體力場的準備:在Gaussian 09 程序中導入激動劑E2、拮抗劑OHT 的結構，通過半經驗方法AM1 分別對兩個配體進行結構優化和電荷計算。通過Amber［29］中的Xleap 對照導出配體的電荷分布。以PRODRG Server v2.5 beta 生成配體的Gromos96 力場文件，并導入Gaussian 09 計算得到的電荷分布結果。

受體文件的準備:模建得到的結構在Discovery Studio 中。以口袋附近氨基酸Glu180 ～Arg221 為參照，與已知ER-α66 模板對應位置Glu353 ～Arg394 對齊，并加入ER-α66 中參與配體結合作用的水分子。然后，選用Gromacs 的pdb2gmx 模塊設定Gromos96 力場，并通過Discovery Studio 軟件加入配體。復合物結構用genbox 模塊加入適量的水分子，水分子采用簡單點電荷(SPC)模型［30］。采用genpr 模塊加入抗衡離子，保證模擬體系的電中性。

對于初始模建結構，使用最陡下降法(steepest descend)對體系進行能量優化。然后在300 K 恒定溫度下進行束縛分子動力學模擬計算:首先束縛配體-受體復合物的所有原子，平衡體系中的溶劑分子;溶劑分子平衡后，依次對配體與蛋白側鏈、α 碳原子之外的蛋白質骨架原子、α碳原子解開束縛。各階段分別進行50 ps 的動力學模擬，降低體系能量。

具體參數設置:步長2 fs，使用Berendsen等［31］提出的壓力-溫度耦合，耦合時間0.1 ps。體系壓強保持在105Pa，采用0.5 ps 耦合時間模擬自由水。模擬水分子的等溫壓縮系數設定為4.5 ×10-10Pa-1。用LINCS(linear constraint solver)算法［32］約束所有原子的鍵長，計算距離小于1 nm 的帶電基團之間的靜電相互作用。用PME(particle-mesh ewald)方法［33］計算長程靜電相互作用，格點寬度設為0.12 nm;Lennard-Jones 相互作用的截斷距離設為1 nm。

最終，對模建的E2-ER-α36 復合物和OHTER-α36 復合物結構分別進行了總長度5 ns 的分子動力學模擬。采用Discovery Studio 的Verify Protein(MODELLER)模塊計算DOPE(discrete optimized protein energy)分值［24］，Verify Protein(Profiles-3D)模塊計算Profiles-3D 分值［34］，并用拉氏圖(Ramachandran)功能［35-36］對生成的蛋白質結構進行驗證。本研究中用到的模型命名見表1。

Table 1 Protein structure nomenclature in current study

1.3 分子對接驗證及條件摸索

為了對ER-α36 的模建結構進行驗證并對配體結合口袋特征進行分析，研究采用AutoDock 4.0［37］對雌激素受體亞型ER-α36 目前已知的4 個配體E2、OHT、genistein 以及G-1 與模建受體結構進行了分子對接研究。各分子結構式見圖1。

Figure 1 Ligands used in current study

配體分子通過AutoDockTools［37］工具加氫加Gasteiger 電荷［38］，并分配原子類型。對接受體為t3g(3ERT 作為模板的ER-α36 結構)，并同樣在AutoDock Tools 中加氫加Gasteiger 并分配原子類型。對接格點中心以配體坐標定位，x、y、z各軸上的對接格點邊長均為40 個單位，每單位為0.0375 nm，組成1.5 nm ×1.5 nm ×1.5 nm 的對接格點。通過AutoGrid 程序進行對接格點計算后，由AutoDock 程序完成對接以及相互作用能評價。ga_num_evals 參數設為25 000 000，ga_num_generatoins 設為27 000，其他參數取默認值。對接結果在Discovery Studio 中進行結合模式的評價，并討論ER-α36 的配體口袋特征。

2 結果與討論

2.1 ER-α36 同源模建及結構優化

圖2 顯示了ER-α36 LBD 與ER-α66 LBD 序列的比對結果。由于基因序列本身與ER-α66 序列同源，僅是mRNA 剪輯有所差異，ER-α36 LBD N 端的大部分一級序列結構與ER-α66 并無區別，僅有的區別在于ER-α36 C 端的26 個氨基酸。由于剪輯變異，這26 個氨基酸取代了原ER-α66 LBD 中C 端的138 個氨基酸，其序列來源為ERα66 基因ESR1 下游64 141 bp 處［10］。從Val458對應的位置開始，ER-α36 中的這部分序列被Ile285 ～Val310 共26 個氨基酸取代，所以無法形成ER-α66 原有的四段α 螺旋結構。

Ile285 之前的Gly284 是最后一個有可靠模板位置信息的氨基酸。該氨基酸位于蛋白H8 的C 端，與口袋內壁相隔H8 以及H5 兩條α 螺旋結構，距離較遠。在模型結構中測量則發現，Gly284中最靠近結合口袋的α-C 原子與結合口袋壁中最近的Trp210 側鏈末端距離約為1.5 nm。相對維系蛋白質的非鍵相互作用，該距離較大［39］。另外，對于26 個氨基酸本身，以BLAST(basic local alignement search tool)方法無法找到對應的模板構建其結構［40］，PSIPRED 方法也無法通過一級序列特征預測其二級結構［41］，其形成規則二級結構的可能性極低。綜上，作者認為ER-α36 LBD 中該段氨基酸對138 個氨基酸缺失已經形成的結構改變影響較小，難以影響結合口袋中的幾何以及電性環境，因此，模建中排除了末端的26 個氨基酸殘基。通過同源模建，得到了E2-ER-α36(t1)和OHT-ER-α36(t3)兩個結構。圖3 為t1 和1ERE 的結構示意圖。

Figure 2 Sequence alignment of ligand binding domain(LBD)of ER-α36 and ER-α66(PDB∶1ERE)

Figure 3 Structures of ER-α36 and ER-α66 LBD

以t1 和t3 作為初始結構，作者對兩個分子進行了5 ns 的分子動力學模擬研究。從計算得到的RMSD 曲線(圖4)可以看到，兩個體系的RMSD 值分別在0.5 ns 和1.5 ns 前持續上升，然后趨于穩定，分別在0.2 nm 和0.25 nm 附近上下波動，說明得到了穩定結構。圖中顯示RMSD 值很小，說明動力學結構相較于初始結構，并無較大差異。作者將動力學后3 ns 模擬時間內的結構進行平均，并通過能量優化得到最終的ER-α36復合物結構(t1g 和t3g)，供下一步分析。

Figure 4 Root mean square deviation(RMSD)of(a)，t1g(b)t3g during 5 ns molecular dynamics simulation

通過拉氏圖可以考察模建結構中各氨基酸殘基的二面角分布情況，從而判斷蛋白結構的合理性［35-36］。在圖5 中可以看到，模型t1g 和t3g 的拉氏圖中，僅有個別氨基酸位于非最優區，分別占激動構象的1.3%及拮抗構象的2.6%，說明該模建的結構較為合理。

Figure 5 Ramachandran plot of agonist-and antagonist-template modeled ER-α36 LBD

DOPE 打分以及Verify Protein 模塊評價同樣也支持了當前模建蛋白結構的合理性。各評價模型的打分情況見表2。

Table 2 Quantitative structure evaluation of different ER-α36 LBD models after molecular dynamics simulation

2.2 ER-α36 結合口袋的特征分析

關于ER-α66 LBD 已有大量深入的結構研究［21，42-44］。在與不同配體結合時，其結合口袋內的殘基構象變化很小。ER-α66 LBD 口袋內部為H3、H6、H8、H11 和H12 等α 螺旋所包圍的強疏水結構。配體一般包含一個甾體骨架，以及兩個其間隔相距約1.1 nm 的羥基。其中一側為酚羥基，苯環平面與口袋一端的疏水夾子相吻合［43］，另一端His524 與甾體骨架另一側的羥基發生極性相互作用。在結合激動劑和拮抗劑的不同情況下，口袋附近H11-H3 處的氫鍵網絡發生變化，引發口袋蓋子H12 構象改變［45］，形成不同的蛋白相互作用平面，與下游信號分子發生蛋白-蛋白相互作用［46-47］。

圖6 展示了作者構建的ER-α36 模建結構?？梢钥吹皆贓R-α36 的配體口袋附近，H3、H6 和H8 得以保留，但H11 和H12 則隨著轉錄剪輯變異消失(圖3)，這對ER-α36 的結構產生了較大的影響。圖6b 展示了ER-α36 結合位點附近的氨基酸，可見位于H11 的有著重要氫鍵作用的氨基酸His524 以及另外兩個氨基酸Gly521 和Met528從ER-α36 的結構中消失。隨之而來的是整個口袋的一端失去了特征性的氫鍵作用中心以及位阻特征，從具有氫鍵定位特征的疏水口袋端點轉化為暴露于溶劑之中的裸露環境，這樣的結構導致ER-α36 的結構牢固性降低、柔性增大。

Figure 6 Binding pocket comparison of ER-α66 and ER-α36

使用LigBuilder V2.0 軟件［48］中的Cavity 模塊進行口袋分析，可以給出關于口袋特征更詳細的定量數據以及形狀分析。t1、t1g、t3 和t3g 配體結合口袋的定量信息列于表3。圖7 展示了4 個受體模型經過Cavity 軟件分析后生成的口袋特征圖。

Table 3 Quantitative measures of binding pockets of different ER-α36 models by Cavity module in LigBuilder V2.0

Figure 7 3D fill-in of different ER-α36 models' binding cavity produced by Cavity module in LigBuilder V2(a)t1，(b)t1g，(c)t3，(d)t3g

從口袋的定量數據對比中可以發現，雖有相同的一級結構，但復合物配體的不同導致了ER-α36 口袋結構在動力學模擬后發生了較大變化。在口袋體積方面，激動構象由0.511 nm3降低到0.375 nm3，拮抗構象由0.459 nm3變化為0.498 nm3。在氫鍵作用點體積方面，激動構象和拮抗構象的各項氫鍵作用點體積都減少了50%以上?？诖畛淠Ｐ蛨D上也可以直觀地發現，兩個受體結構通過動力學模擬的過程，發生了不同形式的形變。原本相似的口袋形狀以及藥效團特征，在動力學模擬之后變得有較大差異，體現了結合口袋很大的柔性。由于沒有了ERα66 中的H11，結合口袋的一端失去了這一α 螺旋的覆蓋和支撐，原本被氨基酸占據的空間現被溶劑填充，兩側氨基酸活動的自由度顯著增大，口袋該側的殘基間極性相互作用顯著減少。對于結合拮抗構象的ER-α36 模型t3，其結合的配體分子OHT 含有拮抗劑所特有的側鏈。因此其在動力學模擬中，口袋邊緣的氨基酸被OHT 的側鏈不斷碰撞而不致顯著縮小，反而在5 ns 的動力學模擬之后發生了顯著增大。

由于一端缺失了3 個重要的氨基酸His524、Gly521 和Met528，結合口袋這一側的開口顯著變大。在OHT 與口袋開口邊緣天冬氨酸的相互作用中，明顯體現了開口變大帶來的影響。作為典型ER-α66 拮抗劑，OHT 的骨架中部延伸出含有季銨氮原子的側鏈，與口袋邊緣的極性殘基發生作用。該作用在ER-α66 晶體結構以及ER-α36模建結構中分別對應Asp351(圖8a)以及Asp178(圖8b)。未經分子動力學優化的ER-α36 結構中，這一相互作用與ER-α66 相比沒有明顯變化。但經過動力學優化，ER-α36 配體結合口袋邊緣逐漸松散。由于缺乏H11 的支撐以及H12 提供的相互作用，自由活動的配體很難保持與Asp178的緊密相互作用，因而該氫鍵特征在動力學優化后的ER-α36 模型中逐漸消失。

Figure 8 Comparison of pocket rim environment between ER-α66 and ER-α36

2.3 分子對接驗證

這一工作是將已知的ER-α36 配體對接入現有的ER-α36 模建結構中，通過評價對接構象和對接打分，驗證模型的合理性并探索ER-α36 特有的結合模式。本文中用于進行對接的配體是E2、OHT、genistein、G-1 四個分子，之前的研究均表明可以通過ER-α36 發生配體依賴的作用［11-12］。其中E2、OHT 分別是經典的ER-α66激動劑和拮抗劑的配體［21-22］。genistein 為ER-β選擇性激動［49］，G-1 則是新報道的ER-α36 膜轉導激活配體［12-13，50］。對接模擬中用到的受體為拮抗構象模板的ER-α36 結構t3g。2.2 節中已討論，與激動構象相比，拮抗構象的口袋邊緣更寬大，易于容納不同大小的配體。故在本部分中使用該構象進行對接。

配體分子與ER-α36(t3g)的結合模式示意圖見圖9。如圖所示，各配體酚羥基均與結合口袋內部的Arg221、Glu180 發生了氫鍵相互作用，同時疏水性骨架部分也與口袋中的疏水性殘基有合理的相互作用。各配體的另一端，則由于缺少了ERα66 中的H11 和H12，位置有一定差異。這源于ER-α36 結構變化所造成的結合位點開口變大。OHT 可與口袋邊緣的Asp178 產生一定的極性相互作用。這點是目前其他已知配體所不具備的。

Figure 9 Interaction pattern of different ligands with ER-α36

以上的對接結果與目前已報道的實驗結果相符，這支持了本研究中所建立的ER-α36 結構。已知分子與ER-α36 的結合模式、其配體取向以及口袋內側相互作用情況與ER-α66 中基本一致，但由于口袋外側的結構變化，配體另一端取向較不固定。

3 結論

本文通過同源模建方法初步建立了ER-α36 LBD 結構模型?，F有的蛋白結構打分、動力學模擬方法以及已發表的配體結合實驗數據，為本模型提供了支持。通過該模型，作者發現了相對ER-α66 的一級結構差異所導致的H9-H12 等重要的二級結構在ER-α36 中缺失。ER-α36 結合口袋內側的化學環境沒有改變，但口袋另一端的α 螺旋結構H11 消失，產生了較大的溶劑暴露面。ER-α36 LBD 部分的結構剛性下降，在不同配體的結合下可能有較大的結合口袋構象差異。通過初步探究ER-α36 的配體結合模式發現，口袋內部的氫鍵相互作用以及口袋中的疏水環境與ERα66 很相似，但口袋外側允許配體殘基更大，或進行更自由的活動。以上結果為進一步研究ERα36 提供了基礎。

［1］ DEROO B J，KORACH K S.Estrogen receptors and human disease［J］. J Clin Invest，2006，116(3):561 -570.

［2］ CALLE E E，MIRACLE-MCMAHILL H L，THUN M J，et al. Estrogen replacement therapy and risk of fatal colon cancer in a prospective cohort of postmenopausal women［J］.J Natl Cancer Inst，1995，87(7):517 -523.

［3］ HENDERSON B E，FEIGELSON H S.Hormonal carcinogenesis［J］. Carcinogenesis，2000，21(3):427 -433.

［4］ LEVIN E R.Invited review:cell localization，physiology，and nongenomic actions of estrogen receptors［J］.J Appl Physiol，2001，91(4):1860 -1867.

［5］ WICKERHAM D L，FISHER B，WOLMARK N，et al. Association of tamoxifen and uterine sarcoma［J］.J Clin Oncol，2002，20(11):2758 -2760.

［6］ FABIAN C J，KIMLER B F. Selective estrogen-receptor modulators for primary prevention of breast cancer［J］.J Clin Oncol，2005，23(8):1644 -1655.

［7］ ETTINGER B，BLACK D M，MITLAK B H，et al.Reduction of vertebral fracture risk in postmenopausal women with osteoporosis treated with raloxifene［J］.JAMA，1999，282(7):637 -645.

［8］ WOOD A J，RIGGS B L，HARTMANN L C.Selective estrogen-receptor modulators-mechanisms of action and application to clinical practice［J］.New Engl J Med，2003，348(7):618 -629.

［9］ HELDRING N，PIKE A，ANDERSSON S，et al. Estrogen receptors:how do they signal and what are their targets［J］. Physiol Rev，2007，87(3):905 -931.

［10］ WANG Z-Y，ZHANG X-T，SHEN P，et al. Identification，cloning，and expression of human estrogen receptor-α36，a novel variant of human estrogen receptor-α66［J］. Biochem Biophys Res Commun，2005，336(4):1023 -1027.

［11］ WANG Z-Y，ZHANG X-T，SHEN P，et al.A variant of estrogen receptor-α，hER-α36:transduction of estrogen-and antiestrogen-dependent membrane-initiated mitogenic signaling［J］. Proc Natl Acad Sci，2006，103(24):9063 -9068.

［12］ KANG L-G，ZHANG X-T，XIE Y，et al.Involvement of estrogen receptor variant ER-α36，not GPR30，in nongenomic estrogen signaling［J］.Mol Endocrinol，2010，24(4):709 -721.

［13］ NOTAS G，KAMPA M，PELEKANOU V，et al. Interplay of estrogen receptors and GPR30 for the regulation of early membrane initiated transcriptional effects:a pharmacological approach［J］. Steroids，2012，77(10):943 -950.

［14］ ZHANG J，LI G-L，LI Z-Q，et al. Estrogen-independent effects of ER-α36 in ER-negative breast cancer［J］.Steroids，2012，77(6):666 -673.

［15］ ZOU Y，DING L，COLEMAN M，et al. Estrogen receptor-alpha(ER-α)suppresses expression of its variant ER-α36［J］.FEBS Lett，2009，583(8):1368 -1374.

［16］ LEE L M J，CAO J，DENG H，et al.ER-α36，a novel variant of ER-α，is expressed in ER-positive and-negative human breast carcinomas［J］. Anticancer Res，2008，28(1B):479 -483.

［17］ CHAUDHRI R， OLIVARES-NAVARRETE R，SCHWARTZ Z. Estrogen receptor alpha-36 expression and function in osteoblast plasma membranes［C］.IADR 86th General Session ＆ Exhibition，Toronto，Canada，2008.

［18］ JIANG H-P，TENG R-Y，WANG Q，et al.Transcriptional analysis of estrogen receptor alpha variant mRNAs in colorectal cancers and their matched normal colorectal tissues［J］. J Steroid Biochem Mol Biol，2008，112(1/3):20 -24.

［19］ LIN S-L，YAN L-Y，LIANG X-W，et al.A novel variant of ER-alpha，ER-alpha36 mediates testosteronestimulated ERK and Akt activation in endometrial cancer Hec1A cells［J］. Reprod Biol Endocrinol，2009，7:102 -110.

［20］ LIN S-L，YAN L-Y，ZHANG X-T，et al. ER-a36，a variant of ER-a，promotes tamoxifen agonist action in endometrial cancer cellsviathe MAPK/ERK and PI3K/Akt pathways［J/OL］. PLoS One，2010，5(2):e9103.

［21］ BRZOZOWSKI A M，PIKE A C，DAUTER Z，et al.Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor［J］. Nature，1997，389(6652):753 -757.

［22］ SHIAU A K，BARSTAD D，LORIA P M，et al. The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen［J］.Cell，1998，95(7):927 -937.

［23］ Accelrys Software Inc. Discovery studio release 2.5［M］.San Diego:Accelrys Software Inc，2007.

［24］ SHEN M，SALI A.Statistical potential for assessment and prediction of protein structures［J］. Protein Sci，2009，15(11):2507 -2524.

［25］ LINDAHL E，HESS B，van der SPOEL D. GROMACS 3.0:a package for molecular simulation and trajectory analysis［J］. J Mol Model，2001，7(8):306 -317.

［26］ Gaussian Inc. Gaussian 09 revision A.1［M］. Wallingford CT:Gaussian Inc，2009.

［27］ DAURA X，MARK A E，van GUNSTERN W F.Parametrization of aliphatic CHnunited atoms of GROMOS96 force field［J］. J Comput Chem，1998，19(5):535 -537.

［28］ SCHUTTELKOPF A W，van AALTEN D M. PRODRG:a tool for high-throughput crystallography of protein-ligand complexes［J］. Acta Crystallogr Sect D:Biol Crystallogr，2004，60(8):1355 -1363.

［29］ PEARLMAN D A，CASE D A，CALDWELL J W，et al.AMBER，a package of computer programs for applying molecular mechanics，normal mode analysis，molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules［J］.Comput Phys Commun，1995，91(1):1 -41.

［30］ BERENDSEN H J，POSTMA J P M，van GUNSTEREN W F，et al.Interaction models for water in relation to protein hydration［J］. Intermol Forces，1981，11(1):331 -342.

［31］ BERENDSEN H J，POSTMA J P M，van GUNSTEREN W F，et al. Molecular dynamics with coupling to an external bath［J］.J Chem Phys，1984，81(8):3684 -3690.

［32］ HESS B，BEKKER H，BERENDSEN H J，et al.LINCS:a linear constraint solver for molecular simulations［J］. J Comput Chem，1997，18(12):1463 -1472.

［33］ DARDEN T，YORK D，PEDERSEN L.Particle mesh Ewald:an N·log(N)method for Ewald sums in large systems［J］. J Chem Phys，1993，98(12):10089 -10092.

［34］ LIITHY R，BOWIE J U，EISENBERG D. Assessment of protein models with three-dimensional profiles［J］.Nature，1992，356(6364):83 -85.

［35］ RAMACHANDRAN G T， SASISEKHARAN V.Conformation of polypeptides and proteins［J］. Adv Protein Chem，1968，23:283 -437.

［36］ LOVELL S C，DAVIS I W，ARENDALL W B，et al. Structure validation by Cα geometry:ψ and Cβ deviation［J］. Proteins:Struct，Funct，Bioinfo，2003，50(3):437 -450.

［37］ MORRIS G M，HUEY R，LINDSTROM W，et al.AutoDock4 and AutoDockTools4:Automated docking with selective receptor flexibility［J］.J Comput Chem，2009，30(16):2785 -2791.

［38］ GASTEIGER J，SALLER H. Calculation of the charge distribution in conjugated systems by a quantification of the resonance concept［J］.Angew Chem(Int Ed Engl)，2003，24(8):687 -689.

［39］ HOOFT R W，SANDER C，VRIEND G. Positioning hydrogen atoms by optimizing hydrogen-bond networks in protein structures［J］. Proteins:Struct，Funct，Bioinfo，1998，26(4):363 -376.

［40］ ALTSCHUL S F，MADDEN T L，SCH FFER A A，et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs［J］.Nucleic Acids Res，1997，25(17):3389 -3402.

［41］ MCGUFFIN L J，BRYSON K，JONES D T. The PSIPRED protein structure prediction server［J］.Bioinformatics，2000，16(4):404 -405.

［42］ MORAS D，GRONEMEYER H.The nuclear receptor ligand-binding domain:structure and function［J］.Curr Opin Cell Biol，1998，10(3):384 -391.

［43］ BOURGUET W，GERMAIN P，GRONEMEYER H.Nuclear receptor ligand-binding domains:three-dimensional structures，molecular interactions and pharmacological implications［J］. Trends in Pharmacol Sci，2000，21(10):381 -388.

［44］ ELLMANN S，STICHT H，THIEL F，et al. Estrogen and progesterone receptors:from molecular structures to clinical targets［J］. Cell Mol Life Sci，2009，66(15):2405 -2426.

［45］ CELIK L，LUND J D D，SCHI TT B.Conformational dynamics of the estrogen receptor α:molecular dynamics simulations of the influence of binding site structure on protein dynamics［J］. Biochemistry，2007，46(7):1743 -1758.

［46］ W?RNMARK A，TREUTER E，GUSTAFSSON J

A，et al. Interaction of transcriptional intermediary factor 2 nuclear receptor box peptides with the coactivator binding site of estrogen receptor α［J］.J Biol Chem，2002，277(24):21862 -21868.

［47］ LEDUC A-M，TRENT J O，WITTLIFF J L，et al.Helix-stabilized cyclic peptides as selective inhibitors of steroid receptor-coactivator interactions［J］. Proc Natl Acad Sci，2003，100(20):11273 -11278.

［48］ YUAN Y，PEI J，LAI L.LigBuilder 2:a practical de novo drug design approach［J］. J Chem Inf Model，2011，51(5):1083 -1091.

［49］ MANAS E S，XU Z B，UNWALLA R J，et al. Understanding the selectivity of genistein for human estrogen receptor-β using X-ray crystallography and computational methods［J］.Structure，2004，12(12):2197 -2207.

［50］ BOLOGA C G，REVANKAR C M，YOUNG S M，et al.Virtual and biomolecular screening converge on a selective agonist for GPR30［J］. Nat Chem Biol，2006，2(4):207 -212.