β-欖香烯取代哌嗪酰胺類衍生物的合成及抗腫瘤活性研究

王敬敬，張美慧，夏明鈺，徐莉英* ，董金華*

(1. 沈陽藥科大學 基于靶點的藥物設計與研究教育部重點實驗室，遼寧 沈陽110016;2. 沈陽藥科大學 藥學院，遼寧 沈陽110016)

廣譜抗腫瘤藥物欖香烯乳的主要成分為β-欖香烯。為改善β-欖香烯的水溶性并提高抗癌活性，本課題組設計在β-欖香烯分子骨架上引入含氧、含氮的極性基團，合成了近300 個β-欖香烯衍生物，并從細胞水平、動物整體實驗以及分子水平上探索了它們的抗癌作用和免疫增強作用［1－9］。體外抗癌活性試驗結果表明，其中β-欖香烯取代哌嗪衍生物DX-1、DX-2 體外對白血病K562、HL60、宮頸癌HeLa、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3、LNCap 等細胞株的IC50值比β-欖香烯的IC50值低1 ～2 個數量級(IC50值約為1 ～10 μmol·L－1)［8］;無明顯骨髓抑制作用(對正常骨髓細胞的抑制率低于腫瘤細胞5 倍)，且對化療藥物耐受的乳腺癌MCF-7/Adr 細胞株具有同樣的敏感性。體內抗癌活性試驗結果表明DX-1、DX-2 在SPF 級BALB/C 裸鼠、昆明種小鼠、C57BL/6 小鼠及ICR 小鼠體內可顯著抑制移植性Lewis 肺癌LL/2、肝癌H22、骨肉瘤S180腫瘤在小鼠體內的原位生長，抑制活性高于或相當于先導化合物β-欖香烯?？拱C制研究表明:DX-1可以抑制HL-60 和HeLa 細胞生長并誘導細胞凋亡，主要以下調c-FLIP(FLICE-like inhibitory protein)蛋白的水平并且誘導活性氧的產生，進而激活caspase-8 來激活外源性途徑誘導HL-60 細胞發生凋亡。此外，β-欖香烯取代哌嗪衍生物還可抑制AKT(下調p-mTOR)和mTOR(下調p-P70S6K)的活性，很可能是一類新的mTOR 抑制劑，但在體內試驗中發現它們的毒性相對較大。因此在本文的工作中采用成酰胺的修飾方法，在β-欖香烯取代哌嗪類衍生物DX-1、DX-2 的哌嗪基4 位氮上引入取代苯甲?；蛉〈奖；?，希望在減小毒性的同時提高抗癌活性。

1 合成路線

按文獻［4］的方法以β-欖香烯(1)為起始原料，經烯丙位的氯代反應，合成β-欖香烯氯代物(2，3)，再通過親核取代反應在β-欖香烯母體上引入取代哌嗪基，經柱色譜分離得DX-1、DX-2，然后再與取代苯甲酰氯或苯丙烯酰氯進行?；磻?，制得β-欖香烯取代哌嗪酰胺類衍生物4a ～4o和5a ～5h。合成路線見圖1。

Figure 1 The synthetic route to β-elemene derivatives

2 合成實驗

核磁共振氫譜用Bruker ARX －300 核磁共振儀測定(TMS 為內標);質譜用美國Waters 公司Alliance QuattromicroTM型液相色譜-串聯四極桿質譜聯用儀測定(電噴霧離子化源ESI);氣相色譜用天美7890 氣相色譜儀檢測。柱色譜用硅膠(51 ～70 μm)、薄層色譜用硅膠GF254均由青島海洋化工廠生產。其余試劑均為市售分析純。

2.1 單氯代β-欖香烯(2、3)的制備

按文獻［1］方法制備，得到β-欖香烯和β-欖香烯氯代物的混合物。經氣相色譜檢測14-氯-β-欖香烯(2)含量為14.8%，13-氯-β-欖香烯(3)含量為33.1%。未經分離用于下一步反應。

2.2 β-欖香烯哌嗪衍生物(DX-1、DX-2)的制備通法

將20 mmol 取代哌嗪溶于10 mL 無水乙醇，攪拌，加熱回流條件下于0.5 h 內滴加β-欖香烯和單氯代β-欖香烯的混合物4.2 g(含化合物2、3約8 mmol)，滴完后在此條件下繼續反應6 h。濃縮，冷卻至室溫后有取代哌嗪鹽酸鹽結晶析出?；旌衔锛尤?0 mL 無水乙醚，濾除取代哌嗪鹽酸鹽，并用無水乙醚洗滌(3 mL ×3)，合并濾液及洗液，濃縮，殘余物用硅膠柱色譜分離，先用石油醚洗脫，得β-欖香烯和未反應的單氯代β-欖香烯，再用乙酸乙酯洗脫得β-欖香烯取代哌嗪DX-1 或DX-2。

2.3 β-欖香烯取代哌嗪酰胺類衍生物(4a ～4o，5a ～5h)的制備通法

按文獻［10］的方法，將取代苯甲酸或取代苯丙烯酸2 mmol 溶于4 mL 的二氯甲烷中，滴加2滴DMF、0.5 mL(5.2 mmol)草酰氯，待溶液變澄清，反應15 min。蒸出多余的草酰氯，加4 mL 干燥的二氯甲烷配制成0.5 mol·L－1的酰氯溶液。

將2 mmol DX-1 或DX-2 溶于4 mL 二氯甲烷，加三乙胺0.2 g(2 mmol)，室溫攪拌0.5 h，冷卻反應體系至0 ～5 ℃。加0.5 mol·L－1的酰氯4 mL，由于不同酰氯的反應活性不同，反應時間為0.5 ～12 h。反應結束后，加入8 mL 飽和碳酸氫鈉溶液，室溫攪拌反應0.5 h，分離有機層，水洗有機層，無水硫酸鈉干燥，蒸出溶劑，經硅膠柱色譜分離得淡黃色油狀物。

共設計合成了23 個未見文獻報道的β-欖香烯取代哌嗪酰胺類衍生物，其結構經核磁共振氫譜、質譜確證，理化及波譜數據見表1。

Table 1 The structures，spectral and experimental date of the target compounds

Continued Table 1

Continued Table 1

Continued Table 1

3 藥理實驗

實驗所用腫瘤細胞株:人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞HepG2、人纖維肉瘤細胞HT-1080、人結腸癌細胞HCT116、人黑色素瘤細胞A375-S2、人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549、人組織細胞淋巴瘤細胞U937、人慢性髓原白血病細胞K562、人原髓細胞白血病細胞HL60。

采用MTT 法測定目標化合物對10 種人癌細胞的增殖抑制作用。將細胞接種在含體積分數10%胎牛血清、體積分數2%谷氨酰胺的RPMI-1640 培養液中，在37 ℃、體積分數5% CO2培養箱中培養。取對數生長期細胞用于抑制率測定實驗，接種細胞濃度為每毫升1 ×105個。將處于對數生長期的細胞，按一定密度接種于96 孔板里(貼壁細胞待貼壁后)。實驗組分別加入不同濃度的受試藥物，空白對照組為190 μL RPMI-1640加10 μL 無藥溶劑。每組設3 個平行孔，37 ℃培養48 h。加入5 g·L－1的MTT 溶液，每孔20 μL，繼續培養4 h，離心棄去上清液，加入150 μL DMSO，振蕩10 min，充分裂解后，用全自動酶標儀于492 nm 處檢測吸光度(OD)值。按下式計算藥物對腫瘤細胞生長的抑制率，從中求出樣品的半數抑制濃度(IC50)。

腫瘤細胞生長抑制率(%) =［A(陰性對照) －A( 加藥組) ］/ A( 陰性對照) ×100%。

以HeLa、MCF-7、HepG2、HCT116、A549、A375-S2、HT1080、HL60、U937 及K562 細胞對所合成的化合物(4a ～4o，5a ～5c，5e ～5g)進行體 外抗增殖活性評價，結果見表2。

Table 2 Inhibition effects of compounds on the growth of tumor cells in vitro

結果顯示，目標化合物對人黑色素瘤細胞A375-S2 的抑制活性高于DX-1、DX-2;對人乳腺癌細胞MCF-7、人肺癌細胞A549、人纖維肉瘤細胞HT1080、人結腸癌細胞HCT116 的活性與化合物DX-1、DX-2 相當;對人髓性白血病細胞HL60、淋巴瘤細胞U937、人類紅白血病細胞K562 的抑制活性明顯低于化合物DX-1、DX-2。在DX-1、DX-2 的哌嗪基4 位氮上引入取代苯甲?；蛉〈奖；玫降?a ～4o 和5a ～5h 兩個系列化合物的活性未表現出特別明顯的差異，苯環上各種取代基的影響也無明顯規律。與DX-1、DX-2 相比，此類化合物體內毒性是否有所降低尚有待進一步研究。

［1］ 徐莉英，陶淑娟，張興忠，等． β-欖香烯芳雜環衍生物的合成及體外抗癌活性研究［J］．中國藥物化學雜志，2006，16(5):277 －280．

［2］ XU Li-ying，TAO Shu-juan，WANG Xian-ming，et al．The synthesis and anti-proliferative effects of β-elemene derivatives with mTOR inhibition activity［J］．Bioorg Med Chem，2006，14(15):5351 －5356．

［3］ 張興忠，徐莉英，陶淑娟，等． β-欖香烯醇酯類化合物的合成及抗癌活性研究［J］． 中國藥物化學雜志，2007，17(1):13 －17．

［4］ 徐莉英，王憲明，于志瀛，等． β-欖香烯胺類衍生物的合成及抗癌活性研究［J］． 中國藥物化學雜志，

2009，19(4):247 －260．

［5］ YU Zhi-ying，WANG Rui，XU Li-ying，et al．N-(βelemene-13-yl)tryptophan methyl ester induces apoptosis and synergizes with arsenic trioxide through a hydrogen peroxide dependent pathway in human leukemia cells［J］． Cancer Lett，2008，269(1):165 －173．

［6］ 徐莉英，張興忠，杜惠蓮，等． β-欖香烯氨基酸衍生物的合成及抗腫瘤活性［J］． 中國藥物化學雜志，

2013，23(3):169 －176．

［7］ 陳光，丁曉飛，肖晉芳，等．欖香烯哌嗪對荷瘤小鼠免疫功能的影響［J］．沈陽藥科大學學報，2007，24

(4):238 －241．

［8］ YU Zhi-ying，WANG Rui，XU Li-ying，et al． β-Elemene piperazine derivatives induce apoptosis in human leukemia cells through downregulation of c-FLIP and generation of ROS［J/OL］． PLoS One，2011，6(1):e15843．

［9］ 陳光，丁曉飛，肖晉芳．欖香烯衍生物誘導HeLa 細胞凋亡的實驗研究［J］．中國藥理學通報，2007，23(2):246 －250．

［10］ 萬伯順，肖遠勝，梁鑫淼，等．一種含氮雜環β-欖香烯酰胺類衍生物其制備及應用:中國，200410050278．6［P］．2006 －02 －22．