PDTC 關節腔注射對兔創傷性OA 軟骨MMP-1、MMP-9 mRNA 表達的影響

董 剛 樂 軍 周 輝 項 東 杭州市中醫院骨傷科 杭州310007

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種最普遍的關節疾病，它所帶來的疼痛、關節功能障礙，嚴重影響患者的生活質量，目前仍缺乏有效的治療措施?；|金屬蛋白酶（MMPs）因能降解幾乎所有的軟骨細胞外基質而被認為在OA 發病過程中起重要作用，是降解細胞外基質的主要酶系，而核因子-κB（NF-κB）則是介導OA 軟骨中各種不利因素對MMPs 基因表達調控的最重要的轉錄因子。近年研究表明，吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）能夠明顯抑制實驗模型中NF-κB的激活，阻斷其下游靶基因的表達，發揮對組織器官良好的保護作用，展示了PDTC 機體應用的良好前景。本實驗旨在觀察PDTC 關節腔注射對兔創傷性OA 軟骨組織MMP-1、MMP-9mRNA 表達及NF-κB 激活的影響，探討PDTC 機體應用預防、延緩創傷性OA 進展的可行性。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 PDTC（美國Sigma 公司），Trizol 試劑（美國Invitrogen 公司）；逆轉錄酶Rtase，dNTP，RNA 酶抑制劑，Taq 酶，隨機寡核苷酸引物（日本TaKaRa 公司）；PCR Marker（美國Fermentas 公司）；NF-κBp65 免疫組化試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 分組造模與處理 健康6月齡純種新西蘭大白兔20 只，由浙江中醫藥大學實驗動物中心提供，雌雄各半，體質量2.4～2.8kg。3%戊巴比妥鈉麻醉，兩組行右膝橫斷前交叉韌帶術（ACLT），并行抽屜實驗確認，術后4天肌注青霉素40 萬U/（kg·d）預防感染，術后1 周隨機分為對照組和PDTC 組，各10 只。PDTC 組關節腔注射PDTC（1mg/mL），1 次2mg，每周2 次，連續8 周；對照組同一時間點關節腔注射等容量生理鹽水。白兔不作固定，分籠飼養，術后1 周強迫白兔活動30min/d，持續2 周，末次用藥3天后處死白兔。

1.3 觀察指標 觀察膝關節積液、滑膜腫脹情況，并于解剖顯微鏡（10 倍）下觀察股骨內髁軟骨退變情況，按以下標準評分：0 分，關節面光整，色澤如常；1分，關節面粗糙，有小的裂隙且色澤灰暗；2 分，關節面糜爛，軟骨缺損達軟骨表中層；3 分，關節面潰瘍形成，缺損達軟骨深層；4 分，軟骨剝脫，軟骨下骨質暴露。

1.4 RT-PCR ①引物設計與合成：檢索NCBI GenBank 數據庫中兔MMP-1、MMP-9的全長mRNA序列，應用primer premier 5.0 軟件設計MMP-1、MMP-9 和內參照β-actin的上下游引物序列，見表1。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。②總RNA 提?。喝」晒莾洒镣俗儏^軟骨組織置于1mL Trizol 液中勻漿，參照Trizol 試劑盒說明書提取總RNA，以紫外分光光度計測定A260/A280 比值≥1.8 控制總RNA 純度。③mRNA 逆轉錄產生cDNA 第一鏈：采用20μL 逆轉錄反應體系，依次加入5×M-MLV 逆轉錄酶緩沖液5μL，M-MLV 逆轉錄酶1μL，10 mmol dNTP 1.25μL，RNAase 抑制劑1.6μL，Oligdt（50pM）2μL，DEPC 去離子水補至20μL，充分混均后42℃反應60 min，95℃滅活逆轉錄酶5min。冰浴10 min，完成cDNA 鏈合成。④PCR 擴增：反應體系為50μL，包含cDNA 10μL，10×PCR 緩沖液5μL，10mmol/L dNTP 1μL，上下游引物各1μL，TaqDNA 聚合酶2U。擴增條件：94℃預變性5min 后，94℃變性30s，55.5℃退火50s，72℃延伸1min，反應30個循環，最后一輪72℃延伸5min，4℃保存。擴增產物取18μL目的基因在1.5%瓊脂糖上電泳，紫外燈下觀察結果并照相，吸光度掃描儀掃描后PCR 條帶用軟件進行定量分析，結果為基因表達量對β-actin 內參的比值，以上結果重復三次，取平均值。

表1 MMP-1、MMP-9、β-actin 引物序列

1.5 免疫組化 4μm 組織切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，3% H2O2（過氧化氫）室溫孵育10min，微波修復抗原10min，溫度92℃～98℃，10%正常山羊血清封閉，室溫孵育10min，鼠抗兔NF-κBp65 血清工作濃度1：100，4℃孵育過夜，生物素標記二抗37℃孵育20min，辣根酶標記鏈霉卵白素37℃孵育20min，DAB（三氨基聯苯二胺）顯色，自來水充分沖洗，復染，封片。用磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照。軟骨切片隨機選取6個高倍鏡視野（400 倍），其中3個位于軟骨表層和中上層，另3個位于軟骨中下層和下層。計算每個視野中胞核、胞質陽性細胞數及細胞總數，NF-κB 活化程度用NF-κBp65 活性系數表示，即NF-κBp65 胞核陽性百分率與胞質陽性百分率的比值。每張切片的細胞計數分別由兩個獨立的觀察者進行，其評分誤差率控制在5%以內，取兩者均值為最后數值。

2 結果

2.1 形態學觀察 兩組多數樣本可見滑膜炎表現，軟骨退變主要位于股骨內髁內側。對照組軟骨膜、軟骨出現糜爛缺損，有潰瘍形成，甚至可見軟骨下骨；PDTC 組關節面色澤灰暗，軟骨膜、軟骨出現糜爛缺損。PDTC 組軟骨退變明顯輕于對照組（P＜0.05）。兩組形態學評分見表2。

表2 兩組形態學評分比較 只

2.2 兩組軟骨MMP-1、MMP-9mRNA 表達 MMP-1、MMP-9、β-actin的RT-PCR 產物電泳結果見圖1（封二），PDTC 組MMP-1、MMP-9mRNA 表達量均低于對照組（P＜0.01），見表3。

2.3 軟骨NF-κBp65 蛋白表達 NF-κBp65 免疫組化，NF-κBp65 陽性細胞胞質或（和）胞核均呈棕黃色顆粒，陰性對照僅見背景著色，對照組軟骨四層均陽性胞核強烈表達，PDTC 組陽性胞核在軟骨四層中亦散在表達，但表層、中上層表達更為明顯，見圖2（封二）。PDTC 組NF-κBp65 活性系數明顯低于對照組（P＜0.01），見表3。

圖1 MMP-1、MMP-9、β-actin 電泳圖。

圖2 軟骨NF-κBp65 表達，DAB 染色×400

表3 兩組MMP-1、MMP-9mRNA 表達量及NF-κBp65 活性系數比較（）

表3 兩組MMP-1、MMP-9mRNA 表達量及NF-κBp65 活性系數比較（）

注：與對照組比較，△P＜0.01

3 討論

3.1 MMP-1、MMP-9 及NF-κB 信號通路在OA 軟骨組織的表達 MMP-1 是OA 發病機制中極其重要的膠原酶，其作用底物主要是I、II、III 型膠原和蛋白多糖，MMP-1 是OA 軟骨中表達水平最高的膠原酶，這樣在對II 型膠原的降解中MMP-1 表達量上的絕對優勢彌補了其相對于其他膠原酶的低效率，使MMP-1 在啟動OA 軟骨基質II 型膠原降解，影響II型膠原降解速率方面起到了主導性作用[1]。MMP-9是明膠酶中的一個重要元素，可將膠原酶變性裂解的II 型膠原進一步裂解，并對IV、V、VII 型膠原、明膠等小分子基質成分有降解作用。Li 等[2]通過對109例OA 患者的血生化檢測證實，OA 患者血清MMP-9表達水平明顯升高，且其敏感性、特異性較高，因此在OA 早期階段影像學不足以反映軟骨退變的情況下，通過對血清MMP-9 表達水平的檢測可對OA 進展作出病理學預測。NF-κB 則是OA 軟骨中重要的轉錄因子，以p50/p65 異二聚體為主要存在形式，當細胞受到IL-1β 等細胞因子刺激時，滯留于胞漿中的p50、p65 亞基在入核引導序列的作用下進入胞核內，與靶基因增強子順式元件κB 序列結合，啟動靶基因的表達，目前的研究已經證實在細胞因子誘導培養的軟骨細胞以及OA 軟骨細胞中存在NF-κB 系統的過量激活[3]。因此以NF-κB 為靶點，抑制NF-κB激活的治療策略受到越來越多學者的關注[4]。

3.2 軟骨組織NF-κB 信號通路與MMP-1、MMP-9基因表達的關系 MMP-1、MMP-9的基因啟動子區域包含典型的NF-κB 結合位點，NF-κB的激活對于它們的轉錄可能是必需的。Toegel 等[5]在研究蘇木提取物對IL-1β 誘導培養人關節軟骨細胞的作用時，發現其不僅能夠明顯抑制軟骨細胞中NF-kB 啟動子的激活，而且明顯抑制軟骨細胞中MMP-1、MMP-9mRNA 表達，這在一定程度上說明了在人關節軟骨細胞中NF-kB 可能是MMP-1、MMP-9 基因的上游轉錄因子。Lu 等[6]研究同樣顯示在細胞因子誘導培養的軟骨肉瘤細胞中，NF-κB 信號通路可能直接或間接的參與了對MMP-1、MMP-9 基因表達的調控。而本實驗發現PDTC 關節腔注射能夠明顯抑制OA軟骨中NF-κB的激活以及MMP-1、MMP-9 mRNA的表達，一定程度上說明在OA 軟骨中NF-κB 激活直接或間接參與對MMP-1、MMP-9 基因表達的調控。

3.3 PDTC 機體應用的可行性 PDTC 是一種抗氧化劑，主要作用于IκB 降解的上游環節（IκBα 磷酸化或IKK 活性水平），是轉錄因子NF-κB的特異性抑制劑。通過抑制NF-κB 活性來抑制下游相關基因的表達已成為近年來的研究熱點。如急性肺損傷或急性呼吸窘迫綜合征時伴隨著肺組織中NF-κB的過量激活，以及腫瘤壞死因子（TNF-α）、胞間黏附分子1（ICAM-1）等炎性細胞因子的大量釋放，進而導致肺炎性損傷、肺功能下降[7]。而應用PDTC 靜脈注射干預急性肺損傷模型后，能夠明顯抑制NF-κB的激活，以及反映肺損傷程度的TNF-α 等炎性細胞因子的過量表達，從而有效改善肺功能[8]。而本實驗顯示，PDTC 組軟骨組織MMP-1、MMP-9mRNA 表達水平明顯低于對照組（P＜0.01），PDTC 組軟骨退變明顯輕于對照組（P＜0.05）。PDTC 在動物模型研究中的良好效果，可能與PDTC 能夠選擇性地抑制NF-κB 激活，抑制炎性細胞因子等NF-κB 下游基因的表達有關，而目前的動物模型實驗中未見PDTC 干預對動物模型毒性的報道，展示了PDTC 機體干預應用的良好前景。

本實驗通過對創傷性兔OA 模型行關節腔注射PDTC，發現PDTC 能夠明顯抑制OA 軟骨中NF-κB信號通路的激活以及MMP-1、MMP-9mRNA 表達，一定程度上減緩、抑制OA 軟骨退變的進程，為OA治療提供了新的臨床靶標。鑒于PDTC 是NF-κB 特異性抑制劑，對MMP-1、MMP-9 基因表達無直接性抑制作用，筆者認為NF-κB的過量激活參與了OA病程的發展，而PDTC 對MMP-1、MMP-9 基因表達的抑制作用正是通過抑制NF-κB的激活而實現，提示在OA 軟骨中NF-κB的激活，直接或間接地參與了對MMP-1、MMP-9 基因表達的調控。

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