閩東地區畬族人群CYP2C19基因多態性分析

林妙春，鄭建明，葉曉峰，游平弟,鄭長業，洪永強

(福建省寧德市閩東醫院中心實驗室，福安 355000)

氯吡格雷、阿司匹林用于缺血性心腦血管疾病的二級預防病人時，常發生氯吡格雷抵抗(clopidogrel resistance)[1]和阿司匹林抵抗(aspirin resistance)[2]現象，表現出較大的個體差異。其原因主要為代謝過程中所依賴的酶的個體差異，即單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphisms, SNPs)。氯吡格雷活化所依賴的CYP450酶存在遺傳多態性[3]，CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因突變可導致氯吡格雷活性代謝產物生成減少，抗血小板作用減弱，造成血小板聚集。不同種族人群CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因突變的發生率不同。福建省福安市是畬族人口分布最多、最集中的地區。至今，閩東地區畬族人群CYP2C19基因多態性分布情況尚不清楚。本研究采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術分析該人群CYP2C19基因多態性的分布，為進行個體化用藥提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 標本、試劑和儀器 標本采集：按知情同意原則，在福安市畬族村采集3代以上屬于畬族原住民的血液標本。研究時間為2011年10月至2013年3月。漢族健康人群血液標本為健康體檢所抽取的外周血，由福建省寧德市閩東醫院檢驗科提供。

血液基因組DNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，瓊脂糖(上海生工公司)，PCR引物由上海生工公司合成并經HPLC純化。PCR試劑盒、Sma Ⅰ內切酶、BamH Ⅰ內切酶、DNA低分子量對照品(加拿大Fermentas公司生產，廈門鷺隆生物科技發展有限公司經銷)。5332型PCR儀、5810R型低溫離心機、移液器(德國Eppendorf公司)；UV-1800PC紫外分光光度計(上海美譜達儀器有限公司)；JS-350型多功能水平電泳槽，JS-680B型凝膠成像圖像分析儀(上海培清科技有限公司)。

1.2 DNA提取 按血液基因組DNA提取試劑盒使用說明書步驟操作，取含EDTA的抗凝血300 μl，進行基因組DNA的提取。提取的DNA用紫外分光光度計測定吸光度(A)并計算濃度及純度，DNA濃度(μg/μl)=A260×50×稀釋倍數/1000，DNA純度=A260/A280。DNA于-20 ℃保存。

1.3 PCRCYP2C19*2的引物分別是Forward:5′-AATTACAACCAGAGCTTGGC-3′ 和Reverse:5′-TATCACTTTCCATAAAAGCAAG-3′；CYP2C19*3的引物分別是Forward: 5′-TATTATTATCTGTTAACTAATATGA-3′和Reverse:5′-ACTTCAGGGCTTGGTCAATA-3′[4]。PCR擴增體系為25 μl，包含12.5 μl PCR混合緩沖液，1 μl DNA模版，1 μl 10 μmol/L的上游引物和下游引物。PCR反應程序：(1) 94 ℃ 預變性5 min；(2)94 ℃變性1 min，57 ℃(CYP2C19*2)和54 ℃(CYP2C19*3)復性1 min，72 ℃延長1 min，37個循環；(3)72 ℃延伸10 min。該擴增程序在PCR儀上完成。

1.4 基因分型 采用PCR-RFLP進行基因分型。CYP2C19*2和CYP2C19*3的PCR產物分別用Sma Ⅰ內切酶和BamH Ⅰ內切酶在37 ℃酶切1 h，酶切產物用3% 的瓊脂糖凝膠電泳顯示條帶。

1.5 統計學處理 基因型分布頻率采用統計軟件SPSS16.0進行χ2檢驗，Hardy-Weinberg遺傳平衡定律驗證。等位基因頻率=等位基因出現的數目/總基因數×100%。

2 結 果

2.1CYP2C19各基因型電泳結果CYP2C19*2的Sma Ⅰ內切酶酶切位點突變，DNA片段不能被切割，顯示為169 bp的單一片段，基因型表示為CYP2C19*2/*2(如圖1中2、3條帶)；若酶切位點只有一側位點突變，酶切產物則顯示49 bp、120 bp、169 bp 3個片段，基因型表示為CYP2C19*1/*2(如圖1中5、6條帶)；野生型CYP2C19*1酶切位點未突變，DNA片段切割為49 bp和120 bp 2個片段，基因型表示為CYP2C19*1/*1(如圖1中條帶4)。CYP2C19*3的BamH Ⅰ內切酶酶切位點突變，DNA片段不能被切割，顯示為329 bp的單一片段，基因型表示為CYP2C19*3/*3(如圖2中1、2條帶)；若酶切位點只有一側位點突變，酶切產物則顯示96 bp、233 bp、329 bp 3個片段，基因型表示為CYP2C19*1/*3(如圖2中條帶3)；野生型CYP2C19*1酶切位點未突變，DNA片段切割為96 bp和233 bp 2個片段，基因型表示為CYP2C19*1/*1(如圖2中條帶4)。

圖1 CYP2C19*2 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖(Sma Ⅰ 酶切)

圖2 CYP2C19*3 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖(BamH Ⅰ酶切)

2.2CYP2C19各種基因型和等位基因 漢族和畬族人群CYP2C19各種基因型和等位基因頻率分布見表1、表2。經χ2檢驗，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，表明這兩個基因的變異被閩東地區漢族和畬族人群所獲得，且變異率可維持在相應的水平上。由表1可見，漢族人群中有21.4%存在CYP2C19*2突變純合體，高于畬族人群(9.4%)，差異顯著(P<0.05)；而兩個民族CYP2C19*3突變純合體的頻率相當，分別為2.9%和2.2%，無顯著差異。漢族與畬族CYP2C19*2突變雜合體的頻率分別為28.6%和30.0%，CYP2C19*3突變雜合體的頻率分別為11.4%和16.7%。由表2可見，漢族CYP2C19*2和CYP2C19*3等位基因頻率均顯著高于畬族人群(P<0.05)。

表1 漢族和畬族人群CYP2C19基因型頻率

表2 漢族和畬族人群CYP2C19等位基因頻率

3 討 論

CYP是一類亞鐵血紅蛋白-硫醇鹽蛋白的超家族，是由一組結構和功能相關的超基因家族編碼的同工酶，主要存在于肝細胞微粒體與線粒體內膜上，是一種末端加氧酶，參與生物體內多種藥物代謝。CYP450酶系最主要的三個家族是CYP1、CYP2和CYP3，其中最重要的7種是：CYP1A2、2A6、2C9、2C19、2D6、2E1、3A4。CYP450參與許多內源性物質,如維生素D3、前列腺素、脂肪酸，及許多外源性物質，如藥物、毒物的代謝。

對于缺血性心腦血管疾病，通常采用氯吡格雷、阿司匹林等進行二級預防，臨床上已證實氯吡格雷抗血小板效果比阿司匹林好，但是價格較高。氯吡格雷作為一種新型噻吩并吡啶類衍生物，是一種前體藥物，需通過氧化作用轉化成2-氧基-氯吡格雷，然后再經過水解形成活性代謝物(一種硫醇衍生物)，這一活性轉化主要依賴于肝臟CYP450酶作用。該活性代謝物通過選擇性地與血小板表面腺苷酸環化酶偶聯的二磷酸腺苷(ADP)受體P2Y12結合，選擇性地抑制由ADP誘導的血小板聚集，同時氯吡格雷還可以阻斷血小板激活后級聯放大效應，抑制非ADP誘導的血小板聚集。然而，氯吡格雷活化所依賴的CYP2C19*2及CYP2C19*3等位基因的突變會導致抗血小板藥物的代謝減弱[5]。美國FDA強調CYP2C19*2及*3基因的重要性，并強調在該等位基因突變率極高的人群中使用氯吡格雷治療時應慎重[6]。本研究選用CYP2C19*2及*3作為研究對象，主要是因為這兩個等位基因突變在東方人中較為常見。CYP2C19*2代謝能力減弱主要表現在CYP2C19 cDNA外顯子5的681位點堿基G突變為A，最終導致無功能蛋白酶的合成。CYP2C19*3的弱代謝則主要表現在CYP2C19 cDNA外顯子4的636堿基G突變為A，導致蛋白質合成提早終止。根據這兩個等位基因突變導致的代謝效率變化，可將個體分為弱代謝者 (poor metabolizers，PM)、中等代謝者 (intermediate metabolizers，IM)、廣泛代謝者 (extensive metabolizers，EM)以及超速代謝者 (ultra rapid metabolizers，UM)4種類型。研究數據顯示，亞洲人群(包括日本、菲律賓及中國)CYP2C19*2及*3等位基因發生率均高于歐美及非洲國家人群[7,8]。而國內各民族(包括漢族、傣族、白族、苗族、侗族等)CYP2C19*2及*3等位基因發生率亦存在差異[9]。

本研究首次測定了閩東地區畬族與漢族人群等位基因CYP2C19*2及*3的發生頻率，結果表明，畬族人群兩個等位基因發生頻率均低于漢族，且差異顯著。該結果與閆春蘭等[10]得到的結果不一致，浙江省畬族人群的CYP2C19*2發生頻率高于漢族(32.5%vs28%)。浙江省的畬族研究樣本來源于學生，大多數年齡較小。而本研究樣本年齡段在19～81歲，為原住民，在飲食方面更加偏向高鹽的傳統食物，且吸煙者比例較學生群體高。因此，推測年齡、飲食以及是否吸煙的差異是造成兩個研究結果不同的原因，有待更深入的研究。另有魏偉等[11]的研究指出，福建省漢族人群的CYP2C19*2和CYP2C19*3的發生頻率分別為32.4%和5.8%，低于本研究的結果。該研究樣本來源于福州地區健康體檢人員，而本研究漢族人群為福安地區健康體檢人員。地域、飲食等差異可能是造成結果不同的原因。

本研究結果表明，福建省福安地區畬族人群中弱代謝者比例較漢族低，因此可以預測畬族人群出血性腦卒中的治療使用氯吡格雷效果更佳。同一種族在不同地區基因型和等位基因頻率也有所差異，實施個體化治療的同時還應該考慮地區因素。有研究表明，影響CYP2C19酶活性的因素除了基因型的不同外，還有性別、口服避孕藥、吸煙等[12]，因此臨床用藥時還需綜合考量各項因素。

總之，CYP2C19等位基因突變率在不同民族、不同地區之間存在差異性。本研究結果為臨床個體化用藥提供了參考依據。課題組今后將在藥物代謝與基因多態性關系上做進一步研究，以促進臨床上個體化治療。

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