電刺激迷走神經對感染性休克大鼠鈣結合蛋白S100A8表達的影響

雷鳴 許開亮 趙龍姝 姚玉龍 陳秀妹

(上海市第七人民醫院重癥醫學科，上海 200137)

細菌內毒素及其誘導生成的大量炎性細胞因子是感染性休克時持續低血壓的重要原因之一。這些炎性細胞因子中，以對腫瘤壞死因子α(TNF-α)研究居多[1]，與之作用相似的另一細胞因子——鈣結合蛋白S100A8近來逐漸受到關注。S100A8 是S100 蛋白家族成員，又稱MRP8 (migration inhibitory factor related protein-8)。S100A8是一個多功能分子，可參與誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖，并在髓系細胞分化以及動物的胚胎發育和免疫炎性反應過程中起重要作用。行使功能時，S100A8通常與S100蛋白家族的另一個成員S100A9(MRP14)形成異二聚體，介導完成生物學功能[2]。越來越多的研究[3-4]表明，在機體受到強烈刺激或在應激狀態下，膽堿能抗炎通路被激活，通過神經及其遞質乙酰膽堿的相互作用，對抗炎性反應因子，降低生物毒素的致死率，調節或對抗全身炎性反應，提示膽堿能抗炎通路對感染性休克導致的過度全身性炎性反應有一定的預防和拮抗作用。本研究采用盲腸結扎穿孔法(cecal ligation and puncture，CLP)制作大鼠感染性休克模型，進而檢測電刺激感染性休克大鼠的迷走神經時血壓、血漿鈣結合蛋白S100A8含量的變化，探究在抗感染性休克中迷走神經興奮所起的作用與相關機制。

1 資料與方法

1.1 實驗所用動物和分組實驗 選取體質量250～300 g的健康雄性Wistar大鼠(SPF級)30只，將大鼠隨機分為6組，每組5只。分組如下：①假電針正常組：假電針刺激迷走神經干；②電針正常組：電針刺激迷走神經干；③假電針CLP組：行CLP術+假電針刺激迷走神經干；④電針CLP組：行CLP術+電針刺激迷走神經干；⑤迷切假電針CLP組：行CLP術+雙頸部迷走神經干離斷術+假電針刺激迷走神經干；⑥迷切電針CLP組：行CLP術+雙頸部迷走神經干離斷術+電針刺激迷走神經干。

1.2 CLP模型建立 大鼠腹腔注射烏拉坦(濃度為200 g/L，劑量為1 g/kg體質量)，麻醉后，行頸總動脈和迷走神經的分離手術；并且對頸總動脈進行置管連接，連續監測直接動脈壓。在大鼠前腹正中作一長2～3 cm的切口，切開后，游離腸系膜和盲腸，用3-0絲線環繞盲腸根部并結扎，再用9號針頭在盲腸端部行兩處穿刺，兩處穿刺位置相距3 mm左右，穿刺后將盲腸還納回腸管，然后逐層縫合，關腹。手術完成后，皮下注射0.9%氯化鈉液(30 mL/kg)，以補充手術過程中丟失的體液。碘附消毒大鼠，包扎傷口。對假CLP組實驗動物不進行結扎手術，亦不進行盲腸穿刺，其余與CLP組操作一致。

1.3 迷走神經離斷和電刺激 麻醉完成后，仰臥位放置大鼠。備皮并進行固定，沿頸腹正中線(喉頭與胸骨之間位置)作2.5～4 cm長的切口，用止血鉗分離胸骨甲狀肌和骨舌骨肌，分離后尋找頸動脈鞘(其內含有頸動脈和頸部神經)。實驗操作者用左手拇指和食指抓住大鼠頸皮和頸肌，用中指指尖頂起頸皮和頸肌使其外翻，右手持玻璃分針或蚊式止血鉗沿著血管走向慢慢將迷走神經和頸總動脈分離3～4 cm，用4-0絲線結扎迷走神經，然后將其剪斷，在遠端將其與雙鉑電極連接。CLP術后立即以5V、2 ms和l Hz強度的電能，持續刺激迷走神經遠端20 min。

1.4 主要試劑及儀器 大鼠鈣結合蛋白S100A8 ELISA試劑盒(南京建成生物技術研究所)，瑞士TECAN公司Infinite 200酶標儀，日本光電公司Nihon kohdensEN-7103電生理刺激儀。

1.5 觀察指標及樣本采集

1.5.1 大鼠的一般狀況及血流動力學指標 CLP術后觀察動物有無寒顫、豎毛、萎靡、膿尿、眼角分泌物增加及腹瀉等表現。平均動脈壓的檢測由頸總動脈連接管進行連續監測。12 h后處死大鼠，解剖并用肉眼觀察不同器官的形態。

1.5.2 血漿鈣結合蛋白S100A8含量的測定 分別在電刺激迷走神經后6 h和12 h，于頸總動脈處采0.8 mL血，置于含EDTA抗凝劑的無菌離心管中，離心(4℃，3500 g)15 min后，吸取上清，保存于-70℃待用。采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血漿鈣結合蛋白S100A8蛋白水平，按試劑盒說明書進行實驗操作。

2 結 果

2.1 大鼠機體狀況和形態學變化 CLP手術后，大鼠活動度減少，出現嗜睡、豎毛，不飲水或飲水減少，呼吸不正常(有時急促)，并伴有有膿尿、腹瀉和眼睛分泌滲出物等。解剖大鼠發現，CLP組和迷切組大鼠出現腹腔滲出液伴血，惡臭；盲腸粘連，有壞疽，腫脹變黑；空腸腸管脹氣；肝臟、肺臟、腎臟等器官水腫并充血，產生瘀點甚至瘀斑等。電刺激組上述變化不明顯。

2.2 大鼠平均動脈壓改變 見表1。

表1 各組大鼠平均動脈壓的變化(mmHg)

2.3 血漿鈣結合蛋白S100A8表達水平變化 模型建立成功后，采用ELISA法檢測血漿鈣結合蛋白S100A8，結果顯示，血漿鈣結合蛋白S100A8含量顯著升高，相比正常組，各相應時間點差異均有統計學意義。切斷迷走神經后，血漿鈣結合蛋白S100A8表達水平上升更明顯，與CLP組相比，各時間點差異均有統計學意義。迷走神經受電刺激后，血漿鈣結合蛋白S100A8表達水平顯著降低；在CLP手術后6 h和12 h均低于迷切假電針CLP組各個時間點的鈣結合蛋白S100A8表達水平，差異有統計學意義。見圖1。

圖1 不同組大鼠CLP術后不同時間點血漿S100A8水平的比較(ng/mL)

3 討 論

發生炎性反應時，中性粒細胞會分泌產生大量炎性因子，包括S100A8。研究[5]表明，S100A8參與了急、慢性炎性反應，炎性反應病灶周圍存在的大量白細胞會被S100A8的趨化作用吸引，進而產生抗炎效應。一方面，促炎物質腫瘤壞死因子(TNF) 以及白細胞介素1(IL-1)、γ- 干擾素(IFN-γ)等均可誘導巨噬細胞或內皮細胞高表達S100A8；另一方面，在特定生理狀態下，S100A8可直接刺激炎性細胞分泌炎性反應分子，參與拮抗炎性反應疾病的過程[6]。另有研究[7]表明，S100A8 作為炎性反應標志分子，比C反應蛋白(C-reactive protein,CRP)更可靠。然而，目前對于S100A8在炎性反應中與迷走神經膽堿能抗炎通路的關系的研究極少。本試驗結果顯示，大鼠接受CLP術后，平均動脈壓進行性下降，血漿中S100A8顯著升高；而電刺激迷走神經后，平均動脈壓下降趨勢減緩，血漿中S100A8水平顯著降低，表明電刺激迷走神經可減輕全身性炎性反應；其機制可能是迷走神經興奮后釋放大量乙酰膽堿；后者與存在于多形核白細胞上的乙酰膽堿受體結合，通過一系列途徑抑制白細胞釋放S100A8，從而拮抗炎性反應。

目前，臨床試驗中用于治療感染性休克的炎性反應因子的抗體和炎性反應介質的拮抗劑等抗炎效果均不理想[7]。最近研究[8]發現，當病菌侵襲機體時，迷走神經可快速作用于巨噬細胞，抑制炎性反應因子的釋放，而達到拮抗炎性反應、保護機體免受損害的目的。因此，迷走神經膽堿能抗炎通路，可以在治療感染或炎性反應性休克中發揮重要作用，為臨床治療休克提供新的思路。膽堿能通路在抗炎性反應中的作用逐漸被揭示并備受關注[9]。S100A8 是一種Ca2+結合蛋白，該蛋白具有促炎性反應活性。目前認為，S100A8 可以調節炎性反應，主要通過參與相應的信號通路實現，而關于S100A8蛋白與膽堿能通路相互作用的研究甚少，這二者是否在抗炎性反應中形成一個反饋是一個值得探討的問題[10]。本試驗研究結果提示，在全身性炎性反應中，迷走神經膽堿能通路會下調S100A8的表達，從而起到抗炎性反應的作用，S100A8在感染性休克抗炎性反應治療中用重要應用價值，有望成為炎性反應預測和治療的新選擇。

[1]TeohNC, Farrell GC.Hepatic ischemia reperfusion injury: pathogenic mechanisms and basis for hepatoprotection[J].J Gastroenterol Hepatol.2003, 18(8):891-902.

[2]Donato R, Cannon BR, Sorci G,et al.Functions of S100 Proteins[J]. CurrMol Med, 2013, 13(1):24-57.

[3]Pavlov VA, Wang H, Czura CJ,et al.The cholinergic anti-inflammatory pathway: a missing link in neuroimmunomodulation[J].Mol Med, 2003, 9(5-8):125-134.

[4]Picq CA, Clarencon D, Sinniger VE, et al. Impact of Anesthetics on Immune Functions in a Rat Model of Vagus Nerve Stimulation[J]. PLoS One, 2013, 8(6):e67086.

[5]饒亞嵐, 陳肖華, 王琳, 等. 7Gyγ射線照射后4h小鼠骨髓差異表達基因的初步研究[J].國際放射醫學核醫學雜志,2007, 31: 245-247

[6]Koy M1, Hambruch N, Hussen J, et al.Recombinant bovine S100A8 and A9 enhance IL-1β secretion of interferon-gamma primed monocytes[J].Vet ImmunolImmunopathol, 2013,155(3):162-170.

[7]Simard JC, Cesaro A, Chapeton-Montes J,et al. S100A8 and S100A9 induce cytokine expression and regulate the NLRP3 inflammasome via ROS-dependent activation of NF-κB(1.)[J].PLoS One, 2013,8(8):e72138.

[8]Martelli D, Yao ST, Mancera J,et al. Reflex control of inflammation by the splanchnic anti-inflammatory pathway is sustained and independent of anesthesia[J].Am J PhysiolRegulIntegr Comp Physiol, 2014, pii: ajpregw.00259.2014 [Epub ahead of print]

[9]胡正芳,李建國,杜朝暉,等. 電刺激迷走神經對感染性休克大鼠肝臟炎性反應的影響[J]. 武漢大學學報(醫學版),2004,25(4):368-372.

[10]Pavlov VA, Wang H, Czura CJ, et al．The cholinergic anti-inflammatory pathway: a missing link in neuroimmunomodulation[J].Mol Med, 2003,9(5-8):125-134.