普羅布考對環磷酰胺致肝損傷的保護作用

張玲 樊華

【摘 要】目的：研究普羅布考對環磷酰胺肝損傷大鼠肝功能的保護作用和其氧化應激的機制。方法：測定普羅布考在不同濃度下對環磷酰胺作用下細胞的增殖活性的影響。將50只大鼠隨機分為5組，空白對照組、模型對照組，普羅布考低、中、高環磷酰胺，每天一次，持續5天，制備環磷酰胺肝損傷模型，10天后檢測大鼠血清ALT、AST及肝組織各氧化指標，同時取肝組織標本觀察病理學改變。結果：用普羅布考孵育能夠明顯提高環磷酰胺作用下HL7702細胞存活率；與模型對照組相比，普羅布考組血清ALT、AST明顯下降（P<0.05），肝組織中NO含量、NOS、GSH和SOD活性明顯上升、MDA含量明顯下降（P<0.05），肝組織病理損傷減輕。結論：普羅布考能降低環磷酰胺所致大鼠腎臟損傷具有保護作用，起保護作用可能與提高抗氧化應激損傷有關。

【關鍵詞】普羅布考；環磷酰胺；肝損傷；氧化應激

【中圖分類號】R965.1 【文獻標識碼】A 【文章編號】1004-7484（2014）06-3492-02

Protective Effect and Mechanism of Probucol in the Hepatic Injury of

Cyclophosphamide-induced rats

【Abstract】Aim To observe the effect of different dosages of probucol on the oxidative stress in the hepatic injury of cyclophosphamide-induced rats. Methods：The hepatic injury models were established by ip injection of cyclophosphamide.All the rats were randomly divided into following groups： normal control rats ，model control，different dosages of Probucol treated hepatic injury rats. After 10 days， ALT、ASTwere detected and the liver tissue was acquired for measuring MDA、SOD、GSH-Px、NO and NOS. Result：Compared with model group， ALT、AST and renal concentration of MDA of probucol 800mg·kg-1 group decreased significantly（P<0.05）， while the activity of SOD、NO、NOS and GSH-Px increased significantly （P<0.05） .Histopathology of mice showed probucol can improve hepatic injury. Conclusion：Probucol can inhibit the oxidative stress in the hepatic injury of cyclophosphamide-induced rats

【Key words】hepatic injury； oxidative stress； probucol

環磷酰胺（cyclophosphamide，CP）是人工合成的氮芥類烷化藥，是臨床上常用的廣譜抗腫瘤藥。大量報道顯示，環磷酰胺可致肝損傷，主要表現為血清谷丙轉氨酶升高，膽汁分泌異常，出現黃疸等[1]，影響腫瘤患者治療，氧化應激在環磷酰胺誘發的化療性肝損傷中發揮著重要作用[2]，因此從抗氧化應激角度尋求一種高效低毒的抗氧化制劑為臨床防治環磷酰胺引起的肝損傷提供新的方法。近年來研究顯示普羅布考可以提高機體抗氧化能力[3-4]，對機體有顯著的保護作用，但普羅布考對肝損傷的保護作用研究較少，因此，本研究觀察肝損傷大鼠氧化應激水平并采用普羅布考進行干預，探討普羅布考對肝損傷大鼠腎臟氧化應激水平的影響及其保護作用，為進一步臨床應用普羅布考進行輔助治療肝損傷提供可能的實驗依據理論基礎。

1 材料與方法

1.1儀器與試藥

主要試劑：環磷酰胺（上海中西醫藥業股份有限公司生產，批號970904），四甲基偶氮噻唑藍（MTT）（美國Sigma公司）；胎牛血清、1640培養基和胰酶（美國GIBCO公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），丙二醛（malondialdehyde，MDA），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒，一氧化氮（nitricoxide，NO），一氧化氮合酶（nitricoxidesynthase，NOS）試劑盒購自南京建成生物工程研究所，普羅布考（河北承德頸復康藥業集團有限公司，批號971103）。

1.2 動物：雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，體重200～240 g，SPF級，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。

1.3 細胞培養：HL7702細胞，購自上海生命科學研究院細胞庫；培養基為含雙抗及10%新生牛血清的RPMI-1640，于37℃，5% CO2，的培養箱中培養，取處于指數生長期的細胞用于實驗。

1.4 普羅布考對環磷酰胺致HL7702細胞的保護作用[5-6]

將HL7702細胞接種于96孔板中，每孔5×103個，培養24h后向各孔中分別加入CP（濃度為4μg/ml），CP+ 普羅布考（濃度依次為200、500、1000μM），每組均設6個復孔，繼續培養48 h，孵育48h后MTT檢測細胞增殖率

1.5 細胞內MDA、GSH蛋白含量的測定

將HL7702細胞3 mL接種到6孔板中，24 h后，分別加入CP（濃度為4μg/ml），CP+ 普羅布考500μM，48 h后，消化細胞并收集，PBS洗2遍，離心棄上清液，PBS清洗，反復凍融3次，3000 r/min離心15 min，取上清液為細胞勻漿，測定MDA、GSH蛋白含量。

1.6 動物分組及處理

將60只SD鼠隨機分為空白對照組、模型組、治療組（普羅布考800、400、200mg·kg-1劑量組）每組12只。除空白對照組外，其余各組腹腔注射100 mg·kg-1環磷酰胺，每天一次，持續5天，制備環磷酰胺肝損傷模型，對照組給予等量生理鹽水，治療組在最后一次注射CTX后給予普羅布考（800、400和200 mg·kg-1），對照組和模型組給予相應體積的生理鹽水，連續給藥10天，末次給藥24h后將大鼠麻醉后在無菌條件下打開腹腔，腹主動脈取血，制備血清待檢。取出腎臟，一部分腎組織用4℃生理鹽水沖洗后，稱重研磨制成勻漿，再離心，取上清液測定MDA水平、SOD和GSH-Px的活性、NO含量和NOS活性。另一部分腎組織光鏡下檢測組織形態學變化[7]。

1.7 統計方法

2 結果

2.1 普羅布考對環磷酰胺致HL7702細胞體外增殖活性的作用

由圖1可知，在本實驗條件下，當普羅布考濃度在1000和500μM時對環磷酰胺造成細胞損傷有顯著保護的作用，當普羅布考濃度達到1000μM時，細胞保護作用下降。

圖1 普羅布考對環磷酰胺致HL7702細胞體外增殖活性的作用

2.2 普羅布考對環磷酰胺致HL7702細胞MDA、GSH的影響

由表1 可知，在本實驗條件下，與對照組相比，CP能夠刺激細胞MDA含量顯著升高（P<0.05），GSH含量顯著降低（P<0.05），而經普羅布考干預后可以顯著降低MDA含量（P<0.05），提高GSH含量（P<0.05）。

2.6 普羅布考對肝損傷大鼠肝組織病理學的影響

在光鏡下檢查證實，正常對照組大鼠肝組織結構清晰、形態正常，無異常病理表現。模型對照組大鼠肝組織病理形態學產生一定的變化，主要表現為肝灶性壞死，肝細胞壞死，壞死灶內及其周圍炎性浸潤，經普羅布考干預后，800mg/kg組病理變化減輕，表現為輕度炎性浸潤。（圖2）

圖2 普羅布考對糖尿病大鼠腎組織的作用. A： 空白對照組，腎組織結構正常；B：模型對照組，肝灶性壞死，肝細胞壞死，壞死灶內及其周圍炎性浸潤；C：普羅布考偶見微小病灶內巨噬細胞聚集和少量淋巴細胞浸潤；D：普羅布考200mg·kg-1組，肝細胞空泡變性，胞漿內可見大小不一的空泡出現

3 討論

肝臟是藥物主要的代謝器官，也常常成為藥物毒副作用的靶器官。環磷酰胺經肝細胞色素CYP450 酶系代謝，形成具有烷化作用的磷酰胺氮芥以及具有毒副作用的丙烯醛，另一方面通過側鏈氧化生成具有毒副作用的氯乙醛。研究表明代謝產物丙烯醛、4-羥化物和氯乙醛與肝毒性有密切關系，丙烯醛、4-羥化物和氯乙醛具有很強的親電子能力，易導致機體抗氧化防御體系的抗氧化能力下降，機體氧化/抗氧化平衡體系嚴重失衡，大量自由基形成，自由基化學性質非?；顫?，極易與細胞結構成分，如膜磷脂、蛋白質、核酸等發生反應，導致細胞重要功能酶活性改變，細胞內、外環境穩態破壞，最終造成氧化應激性肝損傷[8-10]。血清酶學檢查ALT 、AST可以反映肝實質損害及病變的活動性，本實驗采用環磷酰胺制備肝損傷大鼠模型，其ALT 、AST顯著升高，給予普羅布考干預后，ALT、AST顯著下降，提示普羅布考對DN有一定得保護作用。

在本研究中，我們通過體外實驗發現HL7702細胞在環磷酰胺刺激下培養上清中MDA含量增加，，而MDA是脂質過氧化的產物，通過MDA含量可以反映脂質過氧化程度，SOD、GSH是機體主要的抗氧化酶，SOD和GSH水平，是反映機體抗氧化能力的重要標準[11-13]。適當劑量的普羅布考可明顯降低環磷酰胺刺激下細胞MDA升高和GSH降低，提示適當劑量的普羅布考對環磷酰胺造成的細胞損傷有一定的保護作用，且與提高抗氧化應激能力有一定關系。本研究在體外實驗的基礎上，通過體內試驗進一步證實了普羅布考的抗氧化應激能力。

NO、NOS也是機體抗氧化能力的重要指標，本研究發現，肝損傷模型大鼠NO含量降低，NOS活性降低，顯示環磷酰胺對大鼠肝細胞和NOS活性有損傷作用，經過普羅布考干預后，NOS活性增加，NO含量升高，進一步顯示了環磷酰胺對肝臟氧化損傷的保護作用。

腎臟病理組織學檢查同樣證實給予普羅布考后，會明顯改善環磷酰胺引起的肝臟病理變化。肝臟病理形態及肝功能明顯改善，組中腎臟氧化指標則也出現部分緩解和減輕，進一步說明羅格列酮對腎臟的保護作用存在劑量關系。

本研究通過體外研究探索，體內動物實驗證實，普羅布考對肝損傷會產生直接的保護作用，且存在一定的劑量關系，其保護機制可能與降低腎臟組織MDA含量，顯著增加GSH含量和SOD活性，提升NO含量和NOS活性有關，從而提高機體組織抗氧化能力，對于目前臨床上藥物性肝損傷的治療提供了參考依據。

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