PKCβ2 途徑抑制藥物LY333531 延緩高糖誘導心肌纖維化的實驗研究

蘇 文 蘇兆林 陳 暉 李虹偉 王 萍

高糖環境中糖基化終末產物合成增多，氧化應激、炎性因子等激活，從而刺激心臟成纖維細胞的增殖及細胞外膠原的合成，引起糖尿病性心肌纖維化，使心臟順應性和收縮功能下降，發生泵衰竭［1］。糖尿病心肌纖維化進展的速度和程度決定了糖尿病心臟并發癥的預后。而目前臨床上使用的ACEI、ARB、醛固酮拮抗劑等藥物對延緩心肌纖維化雖具有一定作用，但其治療效果有限［2］。

PKC 是絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族的成員，在動物體內分布廣泛，但其亞型具有種屬及器官分布的特異性，人和大鼠心臟中主要分布的PKC 亞型為α、β1、β2、ε 和δ［3，4］。文獻報道，多種信號通路參與了心肌纖維化的過程，在各種原因導致的心肌纖維化中，PKC 途徑的激活起到了至關重要的作用，而針對高糖引起的心肌纖維化過程，又以PKCβ2途徑的作用更為顯著［5］。本實驗在細胞水平上觀察PKCβ2途徑抑制劑LY333531 對高糖誘導大鼠心臟成纖維細胞增殖及活化的影響，為臨床上防治糖尿病心肌纖維化提供新的思路。

材料與方法

1.實驗材料:新生1 ～3 天SD 乳鼠，雌雄不限，由維通利華實驗動物技術有限公司提供。DMEM 培養基:美國Hyclone公司產品，胎牛血清:美國Gibco 公司產品，二甲基亞砜(DMSO)、MTT:美國Sigma 公司產品，LY333531:美國Enzo Life Science 公司產品，抗鼠波形蛋白單克隆一抗、即用型SABC 免疫組化染色試劑盒:武漢博士德生物工程有限公司，PⅠCP、PⅢNP定量酶聯檢測試劑盒:美國EDL 公司產品。胞質蛋白膜蛋白提取試劑盒:北京普利萊基因技術有限公司。

2.實驗方法:(1)大鼠心臟成纖維細胞的原代、傳代培養及純度鑒定:取1 ～3 天SD 乳鼠的心臟，將心室肌組織剪碎，37℃胰酶消化，收集細胞，加入培養液(DMEM +15%胎牛血清+谷氨酰胺+雙抗)，差速貼壁60min，獲得心臟成纖維細胞。光學顯微鏡下觀察細胞形態，并通過抗波形蛋白免疫組化染色法進行鑒定。傳代培養后，2 代細胞能夠達到95%為心臟成纖維細胞的純度，以2 代心臟成纖維細胞作為研究對象。(2)實驗分組:正常糖(normal glucose，NG)組:培養液中含5.6mmol/L D-葡萄糖的DMEM，高糖(high glucose，HG)組:培養液中含25mmol/L D - 葡萄糖的DMEM，HG +LY333531 組:培養液中含25mmol/L D - 葡萄糖的DMEM、200nmol/L LY333531，滲透壓對照(osmotic control，OSM)組:培養液中含5.6mmol/L D -葡萄糖的DMEM、19.4mmol/L 甘露糖。(3)MTT(噻唑藍)法檢測細胞增殖:二代心臟成纖維細胞以5000 個/孔接種到96 孔板上，貼壁后，加入無血清的DMEM 培養液使細胞靜息24h。按實驗分組加入各組培養液，作用48h，培養結束前4h 每孔加入5mg/ml MTT 20μl，4h后每孔加入DMSO150μl 使紫藍色沉淀溶解，在酶聯免疫檢測儀上490nm 波長處測定光吸收值，用只加培養液不加細胞的空白對照孔調零。(4)ELISA 法測定各組PⅠCP、PⅢNP 的表達量:采用雙抗體夾心-ELISA 法，用抗大鼠PⅠCP 單抗包被于酶標板上，標準品和樣品中的大鼠PⅠCP 與單抗結合，加入生物素化抗大鼠PⅠCP 多抗，形成免疫復合物連接在板上，辣根過氧化物酶標記的生物素抗體與之結合，加入酶底物TMB，出現藍色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm 處測A 值。畫出標準曲線。將濃度作為X 軸(對數軸)，A 值作為Y 軸(線性軸)，根據樣品A 值在該曲線圖上查出相應大鼠PⅠCP 含量。PⅢNP 表達量的檢測同PⅠCP。(5)Western blot 法檢測各組PKCβ2活性:收集細胞后，按試劑盒說明分離細胞漿與細胞膜蛋白。將待檢測蛋白樣品上樣，濃縮膠恒壓90V，約20min;分離膠恒壓120V，通過預染蛋白marker 來確定電泳停止時間。電泳結束后，轉移至PVDF 膜上。取出PVDF 膜置平皿，加5%脫脂奶粉封閉液，室溫緩慢搖動1h 進行封閉。封閉結束后加入抗PKCβ2抗體進行結合，封口，室溫緩慢搖動過夜。加辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG(1 ∶500)溶液4ml，封口，置平皿室溫緩慢搖動1 ～2h。取出PVDF 膜，ECL顯影，應用激光光密度儀掃描分析蛋白表達量。

3.數據處理方法:使用SPSS 19.0 統計軟件進行統計分析，所有計量資料均用均數±標準差(±s)表示，多組資料比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，組間兩兩比較用SNK 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.高糖對心臟成纖維細胞PKCβ2途徑蛋白水平的影響:高糖孵育心臟成纖維細胞48h 后，Western blot 法檢測顯示細胞胞質中PKCβ2表達量明顯高于NG 組(0.483 ±0.016 vs 0.190 ±0.017，P ＜0.05)，同時胞膜上PKCβ2表達量亦高于NG 組(0. 453 ±0.015 vs 0.390 ±0. 016，P ＜0. 05)。而對于細胞PKCβ2表達總量來說，HG 組也是明顯高于NG 組(0.940 ±0.102 vs 0.581 ±0.017，P ＜0.05，圖1)?？梢姼咛黔h境可以很大程度上促進心臟成纖維細胞中PKCβ2途徑的活化。

圖1 Western blot 法檢測各組細胞胞質及胞膜中PKCβ2 表達量

2. 高糖對心臟成纖維細胞增殖的影響及LY333531 的干預作用:HG 組的細胞吸光度值明顯高于NG 組(0. 211 ± 0. 020 vs 0.176 ± 0. 016，P ＜0.05)，可見高糖干預可以明顯誘導細胞增殖。OSM組與NG 組的吸光度值相比則無統計學差異(0.182 ±0.015 vs 0.176 ±0.016，P ＞0.05)，表明高糖對成纖維細胞的促增殖作用與滲透壓無關。HG +LY333531 組的吸光度值明顯低于HG 組(0.167 ±0.028 vs 0.211 ±0.020，P ＜0.05)，表明LY333531干預可抑制高糖誘導的心臟成纖維細胞增殖(圖2)。

圖2 MTT 法檢測各組成纖維細胞的增殖數量

3.高糖對心臟成纖維細胞表達PⅠCP、PⅢNP 含量的影響及LY333531 的干預作用:如表1 所示，HG組心臟成纖維細胞表達PⅠCP、PⅢNP 含量明顯高于NG 組，意味著高糖能促使心臟Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達。當加入PKCβ2途徑抑制劑LY333531 與高糖共同孵育心臟成纖維細胞時，PⅠCP、PⅢNP 表達量較HG 組降低，差異有統計學意義(P ＜0.05)，但與NG 組相比，PⅠCP、PⅢNP 表達量仍稍高(P ＜0.05)，可見抑制PKCβ2途徑能很大程度上減少心臟Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達。

表1 各組心臟成纖維細胞表達PⅠCP、PⅢNP 量

討 論

PKC 途徑是細胞內多條信號通路的中心，參與了很多病生理過程，尤其是PKCβ2亞型，與糖尿病并發癥密切相關［6］。在本實驗中，HG 組胞質中和胞膜上PKCβ2表達量均高于NG 組，證明高糖環境可以很大程度上促進心臟成纖維細胞PKCβ2的表達。Xia等［7］發現糖尿病大鼠發生心肌肥厚時心臟內表達增加的主要是PKCβ2信號蛋白及結締組織生長因子，此增加可以被抗氧化劑所拮抗，據此可推測高糖環境通過激活PKCβ2途徑使氧化應激增加，進而促使心肌纖維化進展。

心肌纖維化體現為心肌細胞外基質含量的多少，由心臟成纖維細胞的增殖和活化決定［8］。本實驗用MTT 法比較發現，HG 組心臟成纖維細胞的增殖數量明顯高于NG 組。而心臟成纖維細胞的活化則表現為其合成細胞外基質的增多，構成細胞外基質的蛋白質包括膠原蛋白、層粘連蛋白及纖維連接蛋白等，其中占據主要比例的是Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原。而Ⅰ型膠原形成前裂解的羧基末端形成PⅠCP，Ⅲ型膠原形成前裂解的氨基末端形成PⅢNP，因此本實驗采用PⅠCP及PⅢNP 分別代表Ⅰ型和Ⅲ型膠原的合成量，檢測發現高糖確實可以促進成纖維細胞合成膠原蛋白［9］。LY333531 是目前公認的高選擇性PKCβ2抑制劑，它在治療糖尿病視網膜病變方面已經通過了Ⅲ期臨床試驗，而在治療心肌纖維化方面的研究較少［10］。筆者選用LY333531 作為干預藥物，通過MTT法檢測細胞增殖及ELISA 法檢測PⅠCP 及PⅢNP 的含量，證實使用LY333531 阻斷PKCβ2途徑可以抑制高糖環境下成纖維細胞的增殖和活化，進而抑制心肌纖維化的過程。

綜上所述，本研究初步證實PKCβ2途徑在高糖誘導心肌纖維化的過程中起到重要作用，而LY333531 作為干預藥物抑制PKCβ2途徑可以在一定程度上延緩高糖誘導的心肌纖維化過程。

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