HBeAg 對小鼠骨髓源性樹突狀細胞表型及功能的影響

藍松松 吳樂燦 吳金明 王秀燕 林賢凡 吳文治 黃智銘 吳建勝

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB，以下簡稱乙肝)嚴重危害公眾健康。全球4 億多慢性乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者有極大風險將進展為肝硬化、肝衰竭和肝癌等疾?。?］。目前認為機體對乙型肝炎病毒產生免疫耐受，不能產生有效的特異性免疫反應是導致HBV 慢性感染的主要原因。樹突狀細胞(dendritic cells，DC)作為已知功能最強的抗原遞呈細胞，在機體固有免疫和適應性免疫應答中均發揮重要作用。已有研究發現，慢性乙型肝炎患者的樹突狀細胞存在功能缺陷，其激活特異性抗病毒免疫反應，特別是細胞免疫反應的能力明顯低下［2］。這一現象可能與乙肝病毒和(或)其抗原成分影響DC分化成熟有關。乙肝e 抗原(hepatitis B e antigen，HBeAg)是乙型肝炎病毒復制期間產生的可溶性核衣殼抗原的分泌形式，被認為是宿主對乙肝病毒形成免疫耐受的重要因素［3］。同時，HBeAg 也是臨床上預測慢性HBV 感染者病情轉歸的重要指標之一。HBeAg 可能通過影響DC，下調特異性細胞免疫功能，導致HBV 感染慢性化，但對此明確作用機制的認識仍十分有限。本研究以體外誘導培養的小鼠骨髓源性樹突狀細胞為研究對象，用HBeAg 進行干預，探討HBeAg 對樹突狀細胞表型及功能的影響，并分析其與乙肝免疫耐受的關系，為進一步闡明乙型慢性化機制提供部分實驗依據。

材料與方法

1.主要材料:健康C57BL/6 小鼠，6 ～8 周齡，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，為SPF 級。LPS 購自Sigma 公司;HBeAg 購自北京科衛試劑公司。RPMI-1640、胎牛血清購自Gibico 公司。rmGM -CSF、rmIL -4 購自PeproTech 公司。CD11c microbeads、磁柱購自Miltenyi Biotec 公司。APC 標記的CD11c 及同型對照購自BioLegend 公司。FITC 標記的MHC-Ⅱ，PE - 標記的CD86 及同型購自eBioscience 公司。CCK-8 購自碧云天生物科技有限公司。mouseIL -12p70 酶聯免疫吸附實驗(ELISA)試劑盒購自RD 公司。

2.C57BL/6 小鼠骨髓DCs 的制備及分組:C57BL/6 小鼠斷頸處死，無菌條件下分離小鼠股骨和脛骨。剪除骨兩端，用1ml 注射器吸取RPMI1640 反復沖洗骨髓腔，直至骨變白為止，收集沖洗液，經100 目無菌尼龍濾網過濾后1200r/min 離心10min，去上清后加入適量Tris-NH4Cl 破解紅細胞，再用PBS 洗2 次。將骨髓細胞用含10%胎牛血清、1ng/ml rmIL-4、10ng/ml rmGM-CSF和1%青鏈雙抗的完全培養基重懸，調整細胞濃度為1×106/ml，接種至6 孔培養板中。在37℃、5%CO2條件下貼壁3h 后，去除非貼壁細胞，補足完全培養液。隔日半量換液。待培養第6 天，收集細胞，隨機分為4 組:空白對照組，未加任何刺激即immatureDC(iDC);HBeAg 組，HBeAg(5μg/ml)共培養24h;LPS 刺激組，LPS(1μg/ml)繼續刺激24h;HBeAg+LPS 刺激組，先在培養基中加入5μg/ml HBeAg 培養24h 后，再行LPS(1μg/ml)刺激24h。

3.骨髓源性樹突狀細胞的流式鑒定:收集各組懸浮和半貼壁細胞，調細胞數1 ×107/ml，取0.5ml 加入APC 標記的小鼠CD11c 抗體孵育后，通過流式細胞術(FCM)檢測CD11c 陽性細胞百分比。

4.細胞純化后表型鑒定:收集懸浮和半貼壁細胞，加入CD11c Microbeads，應用MiniMACS 免疫磁珠分選系統分離純化樹突狀細胞，流程嚴格按試劑說明書操作。收集分選后的細胞，PBS 洗2 次，分別加入PE-CD86 和FITC-MHC-Ⅱ及相應同型對照抗體各2μl，，4℃孵育30min 后，流式檢測儀觀察DCs 表面分子變化。

5.同種異體混合淋巴反應(MLR):25μg/ml 絲裂霉素C處理各組DC，37℃孵育30min 后，PBS 洗2 次，再用完全RPMI-1640 培養液重懸成5 ×105/ml，作為刺激細胞。將BALB/c 小鼠脾T 淋巴細胞和各組DC 加入96 孔板共培養，每孔加入淋巴細胞100μl，然后分別加入40、20、10μl 的DC 細胞，每組各設3 個副孔，加培養液至總體積200μl，于37℃，5%CO2培養箱孵育96h。另設只含淋巴細胞的孔為對照組，含RPMI-1640 的孔為本底組。培養結束前4h，每孔各加入CCK-8 試劑20μl，繼續孵育4h，振蕩混勻后，于參比波長650nm、檢測波長450nm 處測定其吸光度(A 值)。刺激結果用刺激指數(stimulating index，SI)表示。SI = (實驗組- 本底)/(對照組-本底)。

6.不同濃度HBeAg 共培養后細胞上清液炎性因子變化:收集細胞上清液，采用IL-12 ELISA 試劑盒檢測細胞上清中IL-12p70 濃度。操作步驟按試劑盒說明進行。反應終止后用酶標儀檢測各樣本450nm 吸光度，再根據標準曲線確定相應濃度。

7.HBeAg 對骨髓源性樹突狀細胞活力影響的檢測:制備小鼠骨髓源性DC，待體外誘導分化第6 天收集懸浮及半貼壁細胞，經CD11c 磁珠分選純化，具體步驟如上述。將分選后細胞重懸成106/ml 后，在96 孔板中接種細胞懸液(100 微升/孔)，分別加入1、2、5μg/ml HBeAg，加培養液至總體積200μl，于37℃、5%CO2培養箱孵育96h。另設只含DC 的孔為對照孔。培養結束前4h，每孔各加入CCK-8 試劑20μl，繼續孵育4h，振蕩混勻后，于檢測波長450nm 處測定其吸光度(A 值)。細胞活力(%)=HBeAg 干預孔A/對照孔A×100%。

8.統計學方法:采用SPSS 17.0 軟件進行分析，數據以均數±標準差(±s)表示。數據采用t 檢驗或單因素方差分析(One-Way ANOVA)，Levene 法檢驗方差齊性，組間多重比較用LSD 檢驗。以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1.HBeAg 對小鼠骨髓源性CD11c 陽性細胞百分率:統計結果顯示空白對照組和LPS 刺激組CD11c陽性的DCs 百分率均＞70%，明顯高于HBeAg 組和HBeAg + LPS 刺激組，差異有統計學意義。說明HBeAg具有一定抑制骨髓前體細胞誘導分化為樹突狀細胞的作用(圖1)。

圖1 不同培養條件下CD11c 陽性細胞百分數

2.DC 表面分子表達的檢測:流式檢測結果顯示，免疫磁珠純化后，CD11c 陽性細胞百分率達到95%以上，該純度可滿足后續實驗需要。未刺激組DC 表面MHC -Ⅱ和CD86 的表達較低。LPS 刺激后細胞表面MHC-Ⅱ和CD86 表達顯著升高。HBeAg 組CD86與MHC-Ⅱ與未刺激組相比，差異無統計學意義(P ＞0.05)。HBeAg+LPS 共刺激組DC 表面CD86 與MHC-Ⅱ均明顯低于LPS 組(P ＜0.01)，提示HBeAg 可明顯抑制LPS 刺激DC 表面重要免疫因子的表達(圖2)。

圖2 不同培養條件下樹突狀細胞表面MHC-Ⅱ和CD86 表達的變化

3.樹突狀細胞刺激淋巴細胞增殖能力的檢測:MLR 結果顯示LPS 刺激成熟的DC 促進淋巴細胞增殖的能力明顯高于其他3 組。未刺激組(對照組)與HBeAg 組促淋巴細胞增殖能力均較低，且差異無統計學意義(P ＞0.05)。HBeAg 處理過的DC 再經LPS刺激，其促異體淋巴細胞增殖能力提高有限，提示HBeAg 可能通過抑制DC 刺激淋巴細胞增殖的能力發揮免疫調節功能(圖3)。

圖3 樹突狀細胞促T 細胞增殖能力檢測

4.細胞培養上清液中IL-12p70 分泌水平:空白對照組、HBeAg 刺激組、LPS 刺激組和HBeAg + LPS組IL -12p70 分泌水平分別為28.01 ±10.21pg/ml、38.92 ±12.18pg/ml、1545.55 ±263.98pg/ml 和513.53±66.77pg/ml，方差齊性檢驗結果顯示方差不齊(Levene法，P ＜0.05)，用Dunnett T3 檢驗行組間多重比較。LPS 刺激后DC 分泌IL -12p70 明顯升高，與余3 組差異均有統計學意義(P 均＜0.01)。經HBeAg 預處理再以同等劑量LPS 刺激后IL -12p70 分泌高于空白組(P ＜0.01)，但仍明顯低于LPS 組(P ＜0.01)。HBeAg 組的IL-12p70 分泌量與對照組的差異無統計學意義(P ＞0.05)，與另兩組比較差異均有統計學意義(P 均＜0.01，圖4)。

圖4 各組DCs 上清液白介素12 分泌水平

5.HBeAg 對細胞活力的影響:1、2、5μg/ml HBeAg組細胞活力分別為85.20% ± 4.38%，84.80% ±3.19%和83.80% ±4.66%，4 組間兩兩比較差異均無統計學意義(P 均＞0.05)，說明不同濃度HBeAg 作用下，DC 的細胞活力無明顯變化，提示HBeAg 并不會明顯降低細胞活力，對細胞無顯著毒性(圖5)。

討 論

圖5 不同劑量HBeAg 對DC 細胞活力的影響

雖然HBeAg 與病毒的組裝和復制均無關，但其在體內乙肝病毒持續感染中發揮巨大作用，現已成為研究的熱點。已有的研究結果表明HBeAg 可導致慢性乙型肝炎患者外周血Th1/Th2 型細胞因子失衡，明顯抑制Th1 型細胞因子IFN -γ 的產生，促進Th2型細胞因子IL -10 和IL -6 的分泌，從而有利于形成對HBV 感染的免疫耐受［4，5］。近年來國內外的研究發現樹突狀細胞在HBV 感染慢性化過程中也發揮重要作用。DC 作為機體重要的抗原遞呈細胞，廣泛分布于全身各器官。未成熟的DC 受到抗原刺激后，在攝取抗原并加工處理抗原過程中逐漸活化，高表達MHC-Ⅰ類/MHC -Ⅱ類分子和共刺激分子(CD80、CD86)，將處理后抗原遞呈給T 細胞使其活化增殖，產生效應細胞誘導免疫激活［6，7］。而慢性乙型肝炎患者外周血DC 表面共刺激分子的表達和炎性因子的分泌功能均下降，表現為成熟功能障礙，提示DC功能障礙與慢性乙肝免疫耐受有關。因此，本研究體外模擬樹突狀細胞生成和活化狀態，探討HBeAg 對樹突狀細胞表型、功能及細胞活力的影響，為進一步明確慢性肝炎形成機制提供部分實驗基礎。

CD11c 是小鼠骨髓源性DC 的特異性標記。本研究發現，HBeAg 共培養情況下，CD11c 陽性細胞比例明顯下降，說明HBeAg 降低了小鼠骨髓細胞體外誘導分化為樹突狀細胞的效率。而DC 產率的降低可能與NF-κB 信號通路的抑制有關。NF-κB 信號通路的活化在DC 的生成過程中發揮重要作用［8，9］。有研究發現HBeAg 可通過特異性地抑制含TIR 結構域的接頭蛋白Mal 和TRAM 參與的TLR 信號通道，進而抑制TLR 通道介導的NF -κB 轉錄激活和隨后的生物學效應［10］。

為了減少培養體系中其他細胞對實驗結果的干擾，后續實驗采用經過CD11c 免疫磁珠分選純化后的DC 為研究對象。研究結果顯示單純HBeAg 作用下，DC 表面免疫分子的表達，促進同種異體細胞增殖的能力及自發IL-12 分泌水平與空白對照組并無明顯差異。然而，HBeAg 卻可抑制LPS 引起的DC 表面MHC-Ⅱ和CD86 的表達，降低LPS 誘導增強的促同種異體淋巴細胞增殖能力，說明HBeAg 有一定抑制樹突狀細胞成熟并影響其功能的作用。

在治療HBeAg 陽性的CHB 患者時，實現HBeAg血清學轉換是重要的目標。臨床數據顯示，IL -12的峰值出現在HBeAg 血清學轉換前及轉換過程中，且較高的IL -12 水平與早期自發HBeAg 血清學轉換有關。DC 是機體內IL-12 的重要來源，IL-12 是一種重要的Th1 型免疫應答誘導因子。本研究發現HBeAg 對LPS 誘導的DC 的IL-12 分泌有明顯下調作用，推斷HBeAg 可通過影響DC IL-12 的分泌，導致T 淋巴細胞免疫應答無法有效激活，這可能也是導致HBV 感染慢性化的機制之一。

病毒和機體的相互作用是多方面的。以往關于CHB 的研究多著眼于效應T 淋巴細胞，對抗原遞呈細胞的研究相對較少，而僅僅針對一種免疫細胞的功能研究無法確切地揭示免疫狀態與CHB 的關系。本研究結果提示HBeAg 對樹突狀細胞并無明顯細胞毒性作用，可能通過抑制樹突狀細胞的生成和活化，使其無法發揮正常功能，進而影響機體對抗原的識別及遞呈功能，最終導致機體特異性免疫應答無法正常啟動，這極可能與HBV 持續感染有關。但是有關HBeAg 干擾DC 的確切機制仍有待于進一步研究，并且課題組也將在今后的臨床研究中探討慢性乙肝患者HBeAg 水平與機體DC 數量和功能的關系。

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