急性低血糖增加大鼠室性心律失常發生風險的研究

王光宇 葉婷婷 張慶勇

據估計，到2030 年全球糖尿病患者將達到4.39億［1］。嚴格控制血糖是糖尿病患者共同目標。但是有研究表明，與傳統的降糖療法相比，嚴格控制血糖增加了嚴重低血糖的發生率。眾所周知，高血糖對人體有害，然而，低血糖的危害卻鮮為人知。在糖尿病患者中，胰島素引起的低血糖致患者死亡比例高達10%［2］。胰島素使用過量導致的死亡和睡眠死亡綜合征密切相關［3］。最近有研究指出，低血糖引起的惡性心律失常病死率增加了77%［4］。多項研究表明，低血糖能刺激自主神經系統導致兒茶酚胺大量釋放，可引起心電變化，包括ST 段改變、QT 間期延長及心臟復極延遲，增加各種心律失常風險，出現異位心律、竇性心動過緩(可進展為心臟停搏)、心房顫動、室性心動過速等［5］。但低血糖引起心律失常的具體機制未完全闡明。國外研究者已分別用胰島素誘導低血糖鉗夾試驗技術或動態血糖監測系統聯合動態心電圖技術觀察了1 型糖尿病低血糖發作時心律失常發生情況、QT 間期變化等。但國內類似研究較少。所以本研究旨在探討急性低血糖易于發生心律失常的機制。

材料與方法

1.實驗動物:健康的SPF 級Sprague -Dawley(SD)雄性大鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供)，平均體重300g。大鼠的飼養條件相同，動物分籠飼養，保持室內相對濕度60% ±5%，溫度23 ～25℃，室內12h 明暗自動切換，飼養標準大鼠飼料，自由攝食，自由飲水。

2.實驗器材及藥品:微型動物呼吸機(ALC-V8)(上海奧爾科特生物科技有限公司)，GE Pruka Mac-Lab 2000 心電生理工作站(美國GE 醫療設備公司)，DF-5A 型電生理刺激儀改良型(蘇州東方電子儀器廠)，心室電極(自制)，18G 腰麻穿刺針(上海醫療器械有限公司)，戊巴比妥鈉(進口分裝)(上海試劑二廠)，諾和靈R［諾合諾德(中國)制藥有限公司分包裝］，血糖儀(ACCU -CHEK Performa)，腎上腺素和去甲腎上腺素試劑盒(美國Sigma 公司)。

3.糖尿病大鼠模型:18 只SD 大鼠禁食12h，自由飲水，STZ 溶解在檸檬酸鈉緩沖液(pH 值4.2 ～4.5)中，按照40mg/kg 劑量腹腔注射。注射后給予正常飲食，3 天后測隨機血糖＞19. 4mmol/L，認為造模成功，血糖未達標大鼠補充1 次STZ［6］。對照組給予相同劑量的生理鹽水腹腔注射。

4.低血糖模型:DMHY 組和NHY 組各9 只大鼠，按照8U/kg 劑量腹腔注射胰島素，30min 測量1 次血糖，當血糖＜3.0mmol/L 時認為是低血糖模型;達不到低血糖模型時按照相應劑量補充胰島素［6］。

5.在體電生理刺激:將發生低血糖的大鼠和其余非低血糖大鼠以40mg/kg 戊巴比妥鈉溶液麻醉后，氣管切開連接呼吸機。開胸，在心尖處與心肌表面呈45°角斜形刺入心室電極，以同樣方法在距離第1 個穿刺位點2 ～3mm 處植入另一根心室電極，兩根電極分別連接放大器輸出端端口，程序刺激儀心室電極正極和負極則連接放大器輸入端對應端口，完成心室電極的植入。將心室電極與心臟電生理儀連接完畢后，啟動電生理刺激儀，刺激部位選擇心室，刺激強度為舒張期閾值的2 倍，S1S1 間期為100ms，8 個S1 后依次發放2 個期前刺激(S2、S3)，從最后一個刺激開始，期前刺激每次遞減2ms，直至S2 出現不應期。S1S1 間期為70ms，每次定數刺激10 次，強度從1V 開始，每一串刺激后刺激強度遞增0.5V，以引起心室顫動的最低強度為心室顫動閾值，刺激完成后測量血糖水平，血糖仍＜3.0mmol/L 的大鼠才納入最后的統計分析。刺激方案見文獻［7］和［8］。

6.收集血清:完成在體電生理刺激后，用10ml 的注射器抽取大鼠下腔靜脈血液，4°離心10min，凍存于-80°，用于鉀離子、腎上腺素和去甲腎上腺素濃度的測定，按照試劑盒說明書操作。

7.統計學方法:使用SPSS 13.0 統計軟件分析數據，其中計量資料以均數±標準差(±s)表示，兩組之間的計量資料采用t 檢驗，兩組之間率的比較采用卡方分析。以P ＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.實驗動物一般情況:SD 大鼠初始體重無明顯差異，造模成功后繼續飼養4 周，不論DM 組還是DMHY 組與相應的N 組和NHY 組比較，體重、實驗前的初始血糖、術后的心臟重量和術后的血糖水平差異均有統計學意義(P ＜0.05)。NHY 組在血糖急劇下降過程中有1 只大鼠出現煩躁、抽搐、昏迷的現象，并最終死亡，測量血糖值是0.6mmol/L，考慮是低血糖導致的死亡。其他大鼠均存活，見表1。

表1 實驗動物一般情況的比較(±s，n=9)

表1 實驗動物一般情況的比較(±s，n=9)

與N 組相比，* P ＜0.05;與NHY 組相比，#P ＜0.05;與DM 組相比，ΔP ＜0.05

組別 體重(g) 初始血糖(mmol/L) 心臟重量(g) 術后血糖(mmol/L)267.40 ±15.16 9.09 ±0.63 1.09 ±0.07 9.23 ±0.56 NHY 組 270.70 ±14.35 8.46 ±1.00 1.05 ±0.06 2.47 ±0.25*DM 組 192.40 ±21.18* 28.46 ±2.49* 0.73 ±0.75* 28.34 ±2.27*DMHY 組 188.90 ±16.43# 26.85 ±3.01# 0.76 ±0.63# 2.54 ±0.18 N 組Δ

2. 血鉀(K+)、腎上腺素(E)和去甲腎上腺素(NE)的濃度:各組在初始條件下K+、E 和NE 的濃度差異無統計學意義(P ＞0.05)，當分別腹腔注射胰島素使血糖濃度＜3.0mmol/L 之后，NHY 組K+、E和NE 的濃度與N 組相比差異均有統計學意義(P ＜0.05);同時，DMHY 組K+、E 和NE 的濃度與DM 組相比差異亦有統計學意義(P ＜0.05)，見表2。

表2 K +、E 及NE 濃度的比較(±s，n=9)

表2 K +、E 及NE 濃度的比較(±s，n=9)

IK +、IE 及INE 分別代表初始血鉀濃度、腎上腺素濃度及去甲腎上腺素濃度;POK +、POE 及PONE 分別代表術后血鉀濃度、腎上腺素濃度及去甲腎上腺素濃度。與N 組相比，* P ＜0.05;與DM 組相比，#P ＜0.05

組別 IK +(mmol/L) IE(pg/ml) INE(pg/ml) POK +(mmol/L) POE(pg/ml) PONE(pg/ml)±28 NHY 組 4.02 ±0.12 487 ±50 193 ±18 2.75 ±0.05* 3042 ±380* 765 ±110*DM 組 4.01 ±0.11 480 ±48 196 ±22 3.92 ±0.16 488 ±50 198 ±25 DMHY 組 3.85 ±0.17 492 ±53 198 ±24 2.63 ±0.02# 3000 ±363# 759 ±116 N 組 3.91 ±0.15 490 ±51 195 ±20 3.84 ±0.13 491 ±48 199#

3.QTc 間期:4 組大鼠在實驗前QTc 間期差異均無統計學意義(P ＞0.05)。當血糖＜3.0mmol/L 后，與N 組相比，NHY 組QTc 間期明顯增加(P ＜0.05)。與DM 組相比，DMHY 組QTc 間期明顯增加(P ＜0.05)。NHY 組和DMHY 組兩組間差異無統計學意義(P ＞0.05，表3，圖1)。

表3 各組QTc 間期的比較(±s，ms)

表3 各組QTc 間期的比較(±s，ms)

與N 組相比，* P ＜0.05;與DM 組相比，#P ＜0.05

組別 注射胰島素前 注射胰島素(或生理鹽水)后168.52 ±8.66 157.29 ±20.79 NHY 組 173.85 ±9.01 212.10 ±24.30*DM 組 176.65 ±9.21 164.14 ±22.30 DMHY 組 165.59 ±9.73 202.10 ±18.30 N 組#

圖1 發生低血糖后各組QTc 間期比較

4.室性快速心律失常的誘發及VF 閾值:DMHY組大鼠室性快速心律失常誘發率較其他各組明顯增高，達88.89%(P 均＜0.05)。DMHY 組和NHY 組誘發率較單純DM 組和N 組增加，分別為88.89%和55.56%，而且兩者間差異亦有統計學意義(P ＜0.05)。DM 組心室顫動閾值為5.56 ±1.45V，比N組(9.25 ±0.56V)明顯降低(P ＜0.05)。DMHY 組和NHY 組心室顫動閾值分別為4.36 ±1.12 和5.79±1.62V，分別較DM 組和N 組明顯降低(P 均＜0.05)，但兩組間比較，差異無統計學意義(P ＞0.05，表4，圖2 ～圖4)。

表4 室性快速心律失常的誘發及VF 閾值

圖2 各組誘發的室性快速心律失常

圖3 各組室性快速心律失常誘發率的比較

討 論

圖4 各組室顫閾值的比較

低血糖一直是治療糖尿病方案中不可避免的不良反應，越來越多的證據顯示低血糖和睡眠死亡綜合征相關，并且推測是由于低血糖誘發了惡性心律失常導致的死亡［2］。本研究作為基礎研究不但設置了糖尿病高血糖組，糖尿病低血糖組，同時設置了正常組和正常低血糖組，較好地觀察了室性心律失常的誘發率、QTc 間期變化、血鉀、腎上腺素及去甲腎上腺素水平，較好地探討了低血糖心律失常的發生機制，有一定臨床意義。本研究主要得出以下幾個重要結果:①NHY 組的室性快速心律失常的誘發率比N 組高，NHY 組的心室顫動閾值比N 組降低;②DMHY 組的室性快速心律失常的誘發率比DM 組高，DMHY 組的心室顫動閾值比DM 組降低;③DM 組的室性快速心律失常的誘發率比N 組高，DM 組的心室顫動閾值比N 組降;④低血糖組血鉀濃度顯著性降低，腎上腺素和去甲腎上腺素濃度顯著性升高;⑤低血糖組的QTc間期比相應組別的QTc 間期明顯延長。

研究表明發生低血糖時，K+、E 及NE 發生顯著性的變化，這些變化都和心律失常密切相關［9，10］。當發生低血糖時，機體交感神經興奮，引起兒茶酚胺類物質大量釋放，而這些物質都可以誘發心律失常。實驗中發現，DNHY 組和NHY 組的E 和NE 濃度都分別比DM 組和N 組高，K+卻比相應組別減少，此外DMHY 組的E 及NE 濃度比NHY 組的E 及NE 濃度相對減少一點，雖然差異無統計學意義(P ＞0.05)，但是也從另一方面說明糖尿病組的心臟自主神經系統發生了病變，不能及時對低血糖等應激條件作出有效的反應，這也是解釋糖尿病組比正常組易于發生心律失常的一個重要原因。而且Chow 等［5］發現夜間低血糖發生的頻率明顯高于白天，表明低血糖引起的神經系統興奮參與心率失常的發生。

實驗還發現低血糖降低了心室顫動閾值，這和以往的研究有所不同，以往的研究將重點放在動作電位的離子通道上，少有研究關注心室顫動閾值這一重要的誘發心室顫動的參考值。研究發現，當發生低血糖時，心室顫動閾值顯著性降低，而且DMHY 組與NHY組相比，兩者之間的差異有統計學意義(P ＜0.05)。DM 組和NHY 組與N 組相比，心室顫動閾值差異也具有統計學意義(P ＜0.05)，這提示糖尿病4 周后造成的心臟神經系統損傷已經相當嚴重。在糖尿病基礎發生的低血糖，無疑進一步降低了心室顫動閾值，增加了室性心律失常發生風險。

實驗同時關注了QTc 間期這一重要信息，它反映了心臟復極化情況。Zhang 等［11］研究發現，低血糖抑制了復極化K+電流，延長了動作電位時程，導致QTc 間期延長，進一步研究發現低血糖抑制HERG K+離子通道，究其原因是低血糖引起內源性ATP 合成減少。本次研究也發現DMHY 組與DM 組相比，QTc 間期明顯延長。NHY 組與N 組相比，QTc 間期也明顯延長。DM 組與N 組相比，QTc 間期也是延長的，但差異無統計學意義(P ＞0.05)。

大量實驗已經證實低血糖易于誘發心律失常，并進行了相關機制研究。但是到目前為止，還沒有哪一種機制能完全解釋低血糖易于發生心律失常的原因。研究結果表明急性低血糖增加了室性心律失常的風險，特別是對于糖尿病大鼠。糖尿病大鼠本身室性心律失常發生率明顯比正常大鼠高，當發生急性低血糖時，室性心律失常的發生率明顯增加，急性低血糖時降低了心室顫動閾值從而促進室性心律失常的發生，血鉀降低、腎上腺素及去甲腎上腺素的升高也參與了心律失常的發生。在某種程度上，低血糖的危害性比高血糖嚴重。最近的一項Meta 分析指出，低血糖不僅增加心血管疾病的病死率，而且也增加了心血管疾病本身的發生率［12］。所以在未來的研究中，需要探索低血糖條件下其他可能參與心率失常發生的機制。

1 Shaw JE，Sicree RA，Zimmet PZ. Global estimates of the prevalence of diabetes for 2010 and 2030［J］. Diabetes Res Clin Pract，2010，87(1):4 -14

2 Skrivarhaug T，Bangstad HJ，Stene LC，et al. Long -term mortality in a nationwide cohort of childhood-onset type 1 diabetic patients in Norway［J］. Diabetologia，2006，49(2):298 -305

3 Tanenberg RJ，Newton CA，Drake AJ. Confirmation of hypoglycemia in the "dead - in - bed" syndrome，as captured by a retrospective continuous glucose monitoring system［J］. Endocr Pract，2010，16(2):244 -248

4 Mellbin LG，Ryden L，Riddle MC，et al. Does hypoglycaemia increase the risk of cardiovascular events?A report from the ORIGIN trial［J］. Eur Heart J，2013，34(40):3137 -3144

5 Chow E，Bernjak A，Williams S，et al. Risk of cardiac arrhythmias during hypoglycemia in patients with type 2 diabetes and cardiovascular risk［J］. Diabetes，2014，63(5):1738 -1747

6 Dave KR，Tamariz J，Desai KM，et al. Recurrent hypoglycemia exacerbates cerebral ischemic damage in streptozotocin -induced diabetic rats［J］. Stroke，2011，42(5):1404 -1411

7 徐振興，李京波，魏盟，等. 通心絡對大鼠心肌梗死后神經重構和室顫閾值的影響［J］. 上海交通大學學報:醫學版，2008，28(8):1003 -1005

8 Chen CC，Lin CC，Lee TM. 17Beta-estradiol decreases vulnerability to ventricular arrhythmias by preserving connexin43 protein in infarcted rats［J］. Eur J Pharmacol，2010，629(1 -3):73 -81

9 Nordin C. The proarrhythmic effect of hypoglycemia:evidence for increased risk from ischemia and bradycardia ［J］. Acta Diabetol，2014，51(1):5 -14

10 Reno CM，Daphna-Iken D，Chen YS，et al. Severe hypoglycemiainduced lethal cardiac arrhythmias are mediated by sympathoadrenal activation［J］. Diabetes，2013，62(10):3570 -3581

11 Zhang Y，Han H，Wang J，et al. Impairment of human ether-a-go-go-related gene (HERG)K+channel function by hypoglycemia and hyperglycemia. Similar phenotypes but different mechanisms［J］.J Biol Chem，2003，278(12):10417 -10426

12 Goto A，Arah OA，Goto M，et al. Severe hypoglycaemia and cardiovascular disease:systematic review and meta-analysis with bias analysis［J］. BMJ，2013，347(4):533