牙周源性牙周牙髓聯合病變患牙微生物感染與影響因素分析

葉　菲，戴方毅，劉　敏

(1.武漢市漢口醫院口腔科，武漢 430012； 2.武漢市3604醫院口腔科,武漢 430033)

牙周源性牙周牙髓聯合病變患牙微生物感染與影響因素分析

葉菲1※，戴方毅1，劉敏2

(1.武漢市漢口醫院口腔科，武漢 430012； 2.武漢市3604醫院口腔科,武漢 430033)

摘要：目的探討牙周源性牙周牙髓聯合病變患牙微生物感染的菌種及影響因素。方法選擇2012年1月至2013年12月來武漢市漢口醫院就診的牙周源性牙周牙髓聯合病變患者和正常正畸拔除者各32例(32顆)為研究對象，采集樣本的牙周袋、根管標本，檢測標本中微生物的感染情況及其牙周源性牙周牙髓聯合病變發病的影響因素。結果32例牙周源性牙周牙髓聯合病變樣本中微生物感染的檢出率為46.9%，以奈瑟菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、彎曲菌屬、梭桿菌屬以及嗜血桿菌屬為主。32例正常對照樣本中微生物感染的檢出率為18.8%，主要為奈瑟菌屬、放線菌屬和彎曲菌屬。奈瑟菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬感染為牙周源性牙周牙髓聯合病變發生的主要影響因素。結論微生物感染的種類與牙周源性牙周牙髓聯合病變的發生密切相關，臨床應采取不同的治療方案以提高聯合病變的治愈率、降低患者失牙率。

關鍵詞：牙周牙髓聯合病變；牙周源性；牙根管；感染現狀

牙周源性牙周牙髓聯合病變指牙周來源、牙髓炎癥與牙周破壞的綜合病變，是失牙的主要原因之一[1]，其發生的主要原因是細菌感染。隨著分子生物學技術的不斷發展，聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳結合法等檢測微生物菌群方法的應用促進了口腔生物學的發展，其明確了牙周牙髓聯合病變的菌群及作用機制，減少了患者的痛苦。本研究采用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳結合法觀察牙周源性牙周牙髓聯合病變患處牙根管的微生物情況，分析其來源及與發病的關系，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012年1月至2013年12月來武漢市漢口醫院就診的牙周源性牙周牙髓聯合病變患者32例，其中男20例、女12例，年齡32~67歲，平均(38.3±5.5)歲?；颊呋佳谰杏跋駥W檢查，選取因慢性牙周炎致Ⅱ°~Ⅲ°松動并拔除的1顆患牙為標本，所取患牙牙周袋深度≥5 mm[2]，可探診深度至根尖，且患牙均無齲、無隱裂等牙體疾病，患者3個月內未使用過抗生素。選取32例同期來院因正畸而拔除牙齒的患者作為對照組，男39例，女13例，年齡33~68歲，平均(39.8±2.8)歲，對照組樣本均無牙體疾病及其他口腔疾病。兩組研究對象在性別、年齡等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫學倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本采集方法牙周袋取樣時，將牙周袋隔濕吹干，以吸潮紙紙尖先行蘸取牙周袋牙冠2/3的齦溝液，之后迅速放入牙周袋底部，20~30 s后取出，以無菌剪刀剪下紙尖尖端5 mm作為牙周袋標本，同時以無菌刮治器探入牙周袋底部，刮取牙根菌斑；根管采樣時，在患牙拔出后，在根尖1/3處截斷，如無成形牙髓，采用蘸有無菌生理鹽水的無菌銼反復銼根尖1/3處的根管后壁，之后將無菌吸潮紙插入，停留20~30 s取出，以無菌剪刀剪下其尖端5 mm作為根管標本。

1.2.2樣本檢測方法樣本離心，去上清后取細菌基因組，DNA提取試劑盒提取DNA[天根生化科技(北京)有限公司]，之后進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增，采用細菌通用引物[3]。模板DNA加熱至93 ℃ 4 min后，模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離形成單鏈，以便與引物結合；模板DNA經加熱變性行成單鏈后，溫度降至55 ℃，引物與模板DNA單鏈按互補原則配對結合；DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈，重復循環變性-退火-延伸過程(根據不同的PCR引物序列，設置不同的退火溫度和時長。第一步擴增：93 ℃變性4 min，56 ℃退火40 s，70 ℃延伸1.5 min；第二步：93 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s；72 ℃優化7 min[4])。PCR反應體系為50 μL，以1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。采用電泳儀，每個樣本取35 μL，變性劑的梯度為40%~60%，進行100%變性；之后采用1∶10 000 的SYBR GreenⅠ核酸燃料染色40 min；然后采用凝膠成像拍照，并將有代表性的條帶進行切膠、克隆測序，并使用GenBank的BLAST對測序結果進行序列分析和序列同源性比較[4-5]。

2結果

2.1微生物檢出情況32例牙周源性牙周牙髓聯合病變中，15例存在微生物感染，檢出率為46.9%。根管和牙周袋的菌種為厚壁菌門的奈瑟菌屬。根管樣本檢測菌屬為放線菌門的棒狀桿菌屬和放線菌屬；牙周袋菌屬為變形菌門的彎曲菌屬、梭桿菌門的梭桿菌屬和變形菌門的嗜血桿菌屬。32例對照樣本中，6例存在微生物感染，檢出率為18.8%，為奈瑟菌屬、放線菌屬和彎曲菌屬(圖1~6)。

2.2牙周袋與根管條帶分析牙周袋樣本菌種條帶值為(10.24±1.98)；根管菌種條帶值為(5.73±1.54)，比較差異有統計學意義(t=9.172，P<0.05)，兩者菌種有不同。對牙周袋和根管菌種條帶進行相似分析，其相似系數為11.4%~68.6%；不同樣本牙周袋細菌條帶相似系數為28.2%~75.9%，根管相似系數為12.2%~48.3%。

2.3微生物感染與發病危險因素以奈瑟菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、彎曲菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬、牙周袋感染、根管感染為因變量，以牙周源性牙周牙髓聯合病變(陽性=1，陰性=0)為應變量Y進行多因素Logistic回歸分析，牙周源性牙周牙髓聯合病變發病的危險因素為奈瑟菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬的感染(P<0.05)，見表1。

表1　微生物感染的種類和部位與牙周源性

3討論

牙髓組織與牙周組織的解剖學結構互通，兩者的感染和病變常相互影響和擴散，因而常導致聯合病變的發生[6]。研究發現，細菌感染是牙周病和牙髓病的主要致病因素[7]。國內外對可能引起牙周源性牙周牙髓聯合病變的細菌種類研究較少，因此本研究檢測牙周牙髓聯合病變患牙中牙周袋和根管內微生物情況，并對患牙微生物感染與牙周源性牙周牙髓聯合病變發生的關聯性進行了研究，以為臨床預防和治療該病提供依據。

本研究結果顯示，32例牙周源性牙周牙髓聯合病變樣本中微生物感染的檢出率為46.9%，而32例正常對照樣本中微生物感染的檢出率為18.8%。根管和牙周袋的形似菌種均為奈瑟菌屬；根管中檢出的菌屬為棒狀桿菌屬和放線菌屬；牙周袋菌屬為彎曲菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬；而正常對照樣本中為奈瑟菌屬、放線菌屬和彎曲菌屬，說明病原微生物可能為棒狀桿菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬。對牙周袋與根管菌種的條帶進行相似分析顯示，其相似系數為11.42%~68.63%，說明兩者的菌種條帶分布屬于不同的操作單位，兩者共有的條帶數較少，也說明牙周袋與根管的細菌的屬類存在差異；根管的相似系數為12.22%~48.28%，推測根管的菌種部分來源于牙周組織。

微生物檢測結果顯示，牙周源性牙周牙髓聯合病變時根管內細菌的種類少于牙周袋，但導致牙周源性牙周牙髓聯合病變的微生物種類與牙周袋微生物種類部分來源相同，這與文獻報道的結果相似[8-10]。本研究Logistic回歸分析顯示，牙周源性牙周牙髓聯合病變的危險因素是奈瑟菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、梭桿菌屬和嗜血桿菌屬的感染，而另有文獻報道，牙周疾病多與牙卟啉單胞菌相關[11-12]，兩者不同的原因可能與選取的對象以及檢測方法不同有關，可通過增加觀察樣本量和采取相同的檢測方法加以解決。有研究證實，不同病原微生物所導致的組織破壞機制和臨床表現不同，因此牙周袋和根管種微生物種類不同，其所導致的牙周牙髓聯合病變程度也可能不同[13]。

總之，口腔內微生物可成為牙周源性牙周牙髓聯合病變的潛在致病菌。臨床可根據不同的致病微生物采取不同的治療方案，以提高牙周源性牙周牙髓聯合病變的治愈率、降低患者失牙率。

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Study on Microbial Infection Periodontal-originated Combined Periodontal-endodontic Lesions and Ralated Risk Factors

YEFei1,DAIFang-yi1,LIUMin2.(1.DepartmentofStomatology,HankouHospitalofWuhanCity,Wuhan430012,China; 2.DepartmentofStomatology,No.3604HospitalofWuhanCity,Wuhan430033,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the correlation between microbial strains and infection situation of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions and related risk factors.MethodsA total of 32 cases of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions and another 32 cases of normal orthodontic pulling teeth treated in Hankou Hospital from Jan.2012 to Dec.2013 were selected as research objects.Samples of periodontal pocket and root tube were collected for microbial testing,and correlation between microbial contamination and the development of disease was analyzed.ResultsThe detection rate of microbial infection in 32 cases of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions was 46.9%,the main microorganisms infected were Neisseria, Corynebacterium,Actinomyces,Campylobacter,Fusobacterium and Haemophilus.The detection rate of microbial infection in 32 cases of normal teeth was 18.8%,the main microorganisms included Neisseria,Actinomyces and Campylobacter.Neisseria,Corynebacterium,Actinomyces,Fusobacterium and Haemophilus were the main factors that influence on the incidence of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions.ConclusionThe species of microorganisms infected are closely related to the incidence of periodontal-origianted periodontal-endodontic combined lesions.Proper therapy should be adopted in clinic in order to improve the cure rate and reduce the rate of lost tooth.

Key words:Periodontal-endodontic combined lesions; Periodontal-origianted; Root canal; Infection situation

收稿日期：2014-03-20修回日期：2014-08-08編輯：辛欣

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.10.068

中圖分類號：R781.4

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)10-1901-03