中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)腸道和肝胰腺5-羥色胺(5-HT)和5-羥色胺受體2(5-HTR2)的定位研究*

楊筱珍 李 彤 李 萌 張佳鑫 黃 堅 徐澤文何 杰 楊志剛 王 春 成永旭

(上海海洋大學 省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室 上海 201306)

健康的消化道生理是動物正常生長繁殖的基礎,因此, 對此方面的基礎研究被廣泛重視。在甲殼動物中, 此類研究多見對肝胰腺的研究, 而少見對其腸道功能的研究(Nunesaet al, 2014)。在PNAS雜志上發表的一篇論文曾提出蟹腸道中所含的激素與其蛻殼息息相關, 同時, 甲殼動物后腸與腸道收縮也密切相關(Chunget al, 1999; Musolfet al, 2009)。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是腸道中重要的神經遞質。哺乳動物的5-HT 95%來源于腸道, 主要是黏膜層的腸嗜鉻細胞。此外, 少數也來源于腸神經元。研究已證實, 5-HT是胃腸道收縮和腸道免疫過程中的重要遞質(Liet al, 2011)。相似的消化道功能在水產動物消化道也已被發現, 如在龍蝦和魚(Scophthalmus maximus)(Bermúdezet al, 2007; Musolfet al, 2009)。除此之外,分布于甲殼動物所有主要神經系統的5-HT, 可刺激高血糖激素、色素分布激素、蛻殼抑制激素和性腺刺激激素的釋放, 進而調節著甲殼動物生長、性腺發育、體色變化和行為(王瓊等, 2006; Tangvuthiponget al, 2006)。因此, 近年來有關5-HT在甲殼動物生理過程中作用的研究倍受關注。2014年國際知名期刊“Science”就發表了5-HT對龍蝦行為影響的研究成果(Fossatet al, 2014)。已有研究表明, 適量給予5-HT能促進中華絨螯蟹(又稱河蟹,Eriocheir sinensis)和羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)的生長, 但其機理并不明晰(Tangvuthiponget al, 2006; 梁攀等,2011)。5-HT在不同物種腸道中及同一個體不同腸段中的分布存在著明顯差異, 了解5-HT在消化道中的分布規律有助于闡明其在各種動物消化生理中的作用(黃輝洋等, 2001; 林樹根等, 2005; 闞延勝, 2007;Heet al, 2009; 陳洪洪等, 2010)。

甲殼動物肝胰腺作為消化腺與腸道和性腺發育及功能密切相關, 其內分布著雌激素受體、甲狀腺素和5-HT等活性物質(楊麗麗等, 2011; Yanget al, 2012;Zaraet al, 2013; Iromoet al, 2014)。Kuo等(2009)發現在5-HT促進羅氏沼蝦卵黃合成的過程中, 肝胰腺是提供卵黃蛋白原的主要來源, 此外, 肝胰腺中的胺氧化酶參與了5-HT的脫胺過程(Nicotraet al, 1994)。本課題組通過免疫組化方法已弄清了日本新糠蝦(Neomysis japonica)肝胰腺中5-HT的分布及其與性腺發育的關系和5-HT合成的關鍵酶色胺酸羥化酶(Tryptophan hydroxylase, TPH1)在中華絨螯蟹在腸道中的分布規律(楊麗麗等, 2011; 李萌等, 2014)。但目前有關5-HT在中華絨螯蟹腸道和肝胰腺中分布的研究尚未見有報道。

5-HT需要與其受體結合后才能發揮生理功能?，F已證明, 根據分子結構、作用機制及不同功能,5-HT受體家族包括7個成員(5-HT1-5-HT7), 是神經遞質受體中最復雜的家族之一(Liet al, 2011)。其中六類是G-蛋白偶聯受體(5-HT1, 5-HT2, 5-HT4, 5-HT5,5-HT6, 5-HT7), 另外一類(5-HT3)是配體門控離子通道?，F已發現5-HT2(5-HT受體2)參與了自閉癥兒童的腸道應激綜合征中的腸收縮異常過程, 并介導著IP3激活 Ca2+信號途徑, 其在哺乳動的疼痛行為及免疫過程中的作用(Hagberget al, 1998; Nishiyama, 2005;Ahern, 2011; Abdelrahmanet al, 2015)也已被發現。目前, 有研究報道了5-HT受體2在龍蝦神經肌肉接點的分布, 并可調節著其后腸腸道的收縮過程(Taboret al, 2002; Musolfet al, 2009), 本課題組現已從中華絨螯蟹腸道成功克隆到 5-HT受體 2片段(徐澤文等,2015)。此外, 甲殼動物腸道收縮直接與腸道排空時間有關, 這也是餌料投喂頻率理論依據(Smithet al,2009)。

中華絨螯蟹的腸道主要分為三個部分, 它們分別為中腸、腸球和后腸, 此三個部分均具有較為獨特的組織結構(李萌等, 2014)。本文利用免疫組織化學技術對5-HT和5-HT受體2在中華絨螯蟹腸道和肝胰腺進行定位, 為進一步研究此類物質在甲殼動物消化生理中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

30只中華絨螯蟹, 購自上海市崇明島綠華中華絨螯蟹養殖基地, 體重為(82.12±10.35)g, 暫養 7d, 饑餓48h后取樣。測量各個體體長, 解剖并分離出腸道和肝胰腺, 以腸球為界線將腸道分為中腸、腸球和后腸三個部分, 分別測量中腸長度、后腸長度和腸道全長(從中腸前端至后腸末端的長度)。新鮮中腸、腸球、后腸和肝胰腺樣品放入Bouin’s液中固定48h, 并采集成年兔小腸作為陽性對照組織, 梯度酒精脫水, 石蠟包埋, 常規切片厚度5—7μm, 40°C烘片機烘干備用。

1.2 免疫組織化學

將中腸、腸球、后腸和肝胰腺的石蠟切片經梯度酒精脫蠟至水, 滴加 3% H2O2, 室溫孵育 20min, 以滅活內源性過氧化物酶, PBS緩沖液(0.01mol/L, pH 7.2—7.6)沖洗 5min×3 次, 枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)進行抗原熱修復, 水浴加熱 94°C, 40min, PBS沖洗5min×3次, 滴加5% BSA封閉非特異性抗原, 室溫孵育 30min, 傾去血清, 滴加兔抗 5-HT(北京中山金橋有限公司)或5-HT受體2抗體(武漢博士德公司)(工作濃度 1︰50), 4°C過夜。次日, PBS沖洗 5min×3次, 滴加二抗, 37°C恒溫箱孵育80min, PBS沖洗5min×3次,DAB顯色, 自來水沖洗, 梯度酒精脫水, 二甲苯透明,中性樹脂封片。陽性對照片為成年兔子小腸切片。陰性對照用 PBS代替一抗, 其余步驟同上, Olympus-2顯微鏡觀察拍照。

1.3 蘇木精-伊紅染色(H.E染色)

石蠟切片經梯度酒精脫蠟至水, 浸入蘇木精染色25min, 鹽酸酒精分色10s, 自來水流水沖洗30min進行返藍, 80%酒精5min, 90%酒精5min, 浸入伊紅染色1min, 經梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 中性樹脂封片, Olympus-2顯微鏡觀察拍照。

1.4 數據分析

用Spot軟件(Scion Corporation, USA), 對中華絨螯蟹每50×103μm2中腸和后腸面積中5-HT和5-HT受體2的陽性免疫細胞數進行統計(n=4)。采用SPSSV11.5軟件的Independent-sample T test進行統計學分析, 實驗結果用均數±標準差,P<0.05為差異顯著。采用Kolmogorov-Smirnov法對將進行相關性分析的數據進行正態分布檢驗, 當滿足正態度分布時, 采用Pearson法相關性檢驗進行相關性分析, 最后在Excel上繪制相關圖表。

2 結果

2.1 中華絨螯蟹腸道長與體長相關性分析

對體長范圍為(5.4±0.21)cm的成年中華絨螯蟹進行解剖后發現: 其腸道主要包括中腸、腸球和后腸,此三部分全長約為(5.7±0.53)cm。腸道的長度與體長度接近, 略大于體長。對腸道長度與體長進行相關性分析后發現, 腸道長與體長呈正相關, 并有極顯著相關性(P<0.01) (圖1)。中華絨螯蟹腸道解剖外觀如圖2所示。開口于中腸前端向頭端延伸, 有一對前盲囊。開口腸球向尾延伸, 有一根后盲囊。腸球位于中腸和后腸之間, 呈膨大的球狀, 后腸開口于腸球下方直至肛門處。中腸和后腸長度見表 1。其中, 后腸長度約為中腸的兩倍, 占全腸道比例為 62%±4%, 而中腸占全腸道的比例僅為29%±3.5%。

圖1 中華絨螯蟹腸道長與體長相關性分析Fig.1 The correlation of body length and intestine length of E. sinensis

圖2 中華絨螯蟹腸道組織解剖圖Fig.2 The anatomy of intestine tissue structure of E. sinensis

表1 中華絨螯蟹中腸和后腸長度及5-HT和5-HT受體2陽性細胞數Tab.1 The length of E. sinensis midgut and hindgut and the number of 5-HT and 5-HTR2 immunoreactive cells in midgut and hindgut

2.2 5-HT和5-HT受體2在中華絨螯蟹中腸、腸球和后腸組織中的分布

中華絨螯蟹的中腸、腸球和后腸組織結構有明顯的差異(圖3a, b, c所示)。經免疫組化染色后發現5-HT和5-HT受體2在中華絨螯蟹中腸, 腸球和后腸組織中均有分布, 免疫陽性物質均呈棕褐色, 兩物質在中腸和后腸組織中的分布特點較為一致。在中腸, 5-HT和5-HT受體2免疫陽性細胞主要分布黏膜上皮細胞間(圖3d和圖3g細箭頭所示)和肌層與外膜交界處(圖3d和圖3g粗箭頭所示), 陽性細胞為胞核著色; 在腸球組織中, 5-HT和5-HT受體2免疫活性細胞勻均分布在腸球外周發達結締組織中, 為胞核著色(圖3e和圖 3h“*”號所示), 在其內側的中腸和后腸中, 分布規律同其在中腸和后腸的分布; 在后腸, 5-HT和 5-HT受體 2免疫陽性細胞主要分布在黏膜上皮細胞細胞間(圖3f和圖3i細箭頭所示)和黏膜下層與肌層(圖3i小框內細箭頭所示)及肌層與外膜交界處(圖 3f和圖3i小框內粗箭頭所示), 均為胞核著染, 在固有膜部分細胞胞核中也有分布(圖 3i“*”號所示)。成年兔子小腸陽性對照片呈現明顯的陽性反應, 陽性細胞主要分布在黏膜上皮間(圖3j細箭頭所示)和肌層間(圖3j和圖3k粗箭頭所示), 用PBS代替一抗均呈陰性反應(圖3l所示)。對中華絨螯蟹中腸和后腸內5-HT和5-HT受體 2陽性細胞進行統計后發現兩物質在中腸和后腸中的分布數量相似, 均約為 61—72個/50×103 μm2(表 1)。

圖3 中華絨螯蟹腸道和肝胰腺5-羥色胺(5-HT)和5-羥色胺受體2(5-HTR2)的定位Fig.3 The location of 5-HT and 5-HTR2-like immunoreactive cells in intestine and hepatopancreas of E. sinensis

2.3 5-HT和5-HT2A受體在中華絨螯蟹肝胰腺中的分布

中華絨螯蟹肝胰腺主要由四種細胞組成, 它們分別是胚細胞(E-cells, embryonic cells)、泡狀細胞(B-cells, blisterlike cells)、吸收細胞(R-cells, resorptive cells)和纖維細胞(F-cells, fibrillar cells) (圖3m所示)。5-HT和5-HT受體2免疫陽性物質主要分布在這四類細胞的胞核, 在 F細胞的細胞質中也有陽性表達(圖3n和圖3o所示)。

3 討論

本研究發現, 中華絨螯蟹腸道長與體長有明顯的正相關, 且與體長長度相近。這與許多動物腸道盤繞于體內, 其長度遠遠大于體長完全不同。本課題組前期已對中華絨螯蟹的腸道組織結構進行了詳盡的描述, 并發現后腸與中腸有明顯的組織結構區別, 如黏膜表面有角質層, 有明顯的固有膜和肌層, 有腸腺的分布等(李萌等, 2014)。本研究發現中華絨螯蟹的后腸大部分位于中華絨螯蟹腹臍內更易于外環境接觸, 其占據了腸道的大部分, 約占腸道比例為60%?，F已有研究發現蟹腸道所含的高血糖激素與蛻殼密切相關, 5-HT參與了后腸的收縮調節(Chunget al,1999; Musolfet al, 2009)。McGaw等(2013)研究了食物的不同大小與動物個體的不同大小在甲殼動物不同腸道段的推進差別(McGawet al, 2013)。綜上, 我們認為對中華絨螯蟹消化生理的研究, 有必要對腸道分段進行研究, 此外, 后腸生理功能的研究應更加重視。

已有研究表明, 水體中適量的5-HT能夠促進中華絨螯蟹仔蟹的生長, 因此, Tangvuthipong等曾建議,將5-HT作為羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)幼體飼料添加成分, 以促進其生長(Tangvuthiponget al,2006; 梁攀等, 2011), 而其作用機理尚不明晰。5-HT是調節胃腸運動的一種重要介質, 在不同動物消化道組織中5-HT免疫活性細胞的分布情況差異較大, 如在鋸緣青蟹(Scylla serrata)主要分布于腸道的黏膜層和黏膜下層, 中腸多于后腸; 而在中國對蝦(Penaeus chinensis)和日本沼蝦(Macrobrachium nipponense), 主要分布于中腸和后腸的結締組織中, 且在中腸和后腸數量相近; 在大黃魚(Pseudosciaena crocea)和羅非魚(Tilapia mossamblca), 主要分布在黏膜上皮間, 少量分布于固有膜, 在大黃魚后腸較中腸多, 而在羅非魚中腸高于后腸; 在鯰魚(Ictalurus punctatus), 5-HT免疫活性細胞主要分布于腸道的黏膜上皮層和肌肉與外膜交界的肌肉層, 且在中腸的數量高于后腸(黃輝洋等, 2001; 林樹根等, 2005; 闞延勝, 2007; Heet al, 2009; 陳洪洪等, 2010)。本研究首次發現 5-HT活性細胞在中華絨螯蟹腸道中也有廣泛分布, 其在中腸和后腸的分布規律基本一致。5-HT陽性細胞主要分布在腸道的黏膜上皮層和外膜與肌層的交界處。這與在鯰魚(Ictalurus punctatus)中的報道相似(Heet al,2009)。中華絨螯蟹的中腸缺乏固有膜, 這也是中華絨螯蟹腸道的一個特點, 本研究發現在中華絨螯蟹后腸固有膜和黏膜下層與肌肉層的交界處中也有5-HT陽性細胞的分布, 這與鋸緣青蟹(Scylla serrata)5-HT免疫活性物質還分布于黏膜下層相同(黃輝洋等,2001)。但上述的文獻資料中均未提及5-HT陽性細胞與肌細細胞毗鄰的現象。5-HT參與了后腸肌細胞收縮,在龍蝦中已有報道(Musolfet al, 2009)。我們推測在肌肉層較發達的中華絨螯蟹后腸, 5-HT和5-HT受體2分布于黏膜下層與肌層及肌層與外膜交界處, 這樣分布的現象可能與5-HT參與腸道收縮有關, 本課題近期對中華絨螯蟹腸道鋪片的研究也發現在中華絨螯蟹后腸黏膜下層中有大量內分泌細胞分布, 通過電鏡觀察在固有膜和肌細胞間均有類似的內分泌細胞分布(結果待發表)。外源給予5-HT能促進甲殼動物生長是否與其能促進腸道收縮, 進而促進攝食有關, 還有待于進一步證實。本課題組先前也已證實5-HT生物合成中的關鍵酶TPH1在中華絨螯蟹中腸和腸球黏膜上皮細胞胞核和后腸黏膜上皮細胞漿中有分布(李萌等, 2014)。綜合上述研究, 我們認為中華絨螯蟹腸道中有大量5-HT的分布, 其分布位置主要在腸黏膜上皮層、腸固有膜、黏膜下層與肌肉層的交界處和外膜與肌層的交界處。

與魚類的肝胰腺不同, 中華絨螯蟹的肝胰腺主要由四種不同類型細胞組成, 各類型細胞功能也不同, 已有研究表明, 肝胰腺的B/R細胞有進入腸道參與消化吸收的過程, 我們在實際解剖的過程中也?？吹侥c腔內有類似于肝胰腺的組織出現(Smithet al,2009)。而F細胞能合成大量消化酶, 胰蛋白酶、糖酶、酯酶等, 還能儲藏大量的鈣, 其在甲殼動物蛻皮和饑餓等生理過程中扮演著重要角色(Nunesaet al, 2014)。除此之外, 肝胰腺還參與了甲殼動物的性腺發育的調控, 本課題組先前的研究已發現5-HT在日本新糠蝦(Neomysis japonica)不同卵巢發育期肝胰腺各類型細胞胞核中的分布(楊麗麗等, 2011; Zaraet al, 2013)。本研究也再次證明, 肝胰腺各類型細胞的胞核是5-HT分布的主要部位。而F細胞或其它類型肝胰腺細胞在中華絨螯蟹消化道生理或免疫中的作用, 還需要更深入的研究。

眾所周知, 5-HT功能的發揮, 需要與其相應的受體結合。本研究發現5-HT和5-HT受體2在中華絨螯蟹腸道和肝胰腺組織中的分布規律一致, 表明中華絨螯蟹消化道5-HT發揮生理功能可能與5-HT受體2有關。已有研究發現5-HT受體2參與了腸道平滑肌收縮的過程, 并在顆粒細胞和巨噬細胞中有表達, 而參與免疫過程(Ahern, 2011; Abdelrahmanet al,2015)。它與腸道的黏膜免疫密切相關。本課題組新近的研究已發現中華絨螯蟹腸道中有嗜酸性的肥大細胞分布(趙柳蘭等, 2014)。此外, 中華絨螯蟹存在著腸道免疫過程, 生物胺能夠影響中華絨螯蟹的免疫功能, 但有關 5-HT在腸道免疫中的作用還有待于進一步探究(Zhaoet al, 2012)。

4 結論

本文首次對中華絨螯蟹腸道與體長相關性進行分析, 并統計了中腸和后腸腸段所占比例。為進一步分段研究腸道功能奠定理論基礎。本研究發現在中華絨螯蟹中腸、腸球、后腸和肝胰腺中均有 5-HT和5-HTR2的分布。結合前期研究已從腸道組織成功獲得5-HTR2核心片段。我們認為5-HT參與了中華絨螯蟹腸道的生理過程。雖然, 5-HT和5-HTR2在中腸和后腸中定位與數量基本相似, 但由于后腸結構的差異和解剖位置(大部分位于腹臍部), 我們還在后腸固有膜和發達肌層內和外側有大量發現。因此, 今后對中華絨螯蟹消化道功能研究中, 應更加關注后腸的生理功能, 如其在腸道收縮和免疫中的作用。有關中華絨螯蟹腸道收縮的研究在應用方面可以通過獲得中華絨螯蟹腸道排空時間, 進而指導中華絨螯蟹的科學投喂頻率。

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