魷魚(Squid)肝臟蛋白酶解物中ACE活性抑制肽的分離純化及活性分析*

梁 佳 謝 超 林 琳 黃 菊 王 婷 俞群娣

(浙江省海產品健康危害因素關鍵技術研究重點實驗室 浙江海洋學院食品與醫藥學院 舟山 316022)

魷魚產量巨大, 全世界有中國、挪威等超過 60個國家和地區從事魷魚捕撈加工生產, 而魷魚的消費和利用也以這些國家和地區為主(李桂芬, 2003)。在魷魚加工過程中產生大量的下腳料(袁亞輝等,2002)。主要包括內臟, 皮、頭等廢棄物, 這些物質通常被利用加工成魚粉或者作為廢棄物掩埋, 產品附加值低, 不利于魷魚加工行業的發展, 而且造成環境污染(王建中等, 1999; 陳意, 2006)。國外對魷魚加工下腳料的利用主要通過生物技術對其進行處理, 加工成各種高營養蛋白食品, 使其蛋白質資源充分利用(FAO, 1998)。在國內魷魚肝臟的利用僅有魷魚肝臟干粉的加工, 并且是用作飼料, 技術水平不高(秦玉青等, 2002; 趙紅偉, 2003)。魷魚肝臟中分離提取的各種生物活性肽(程云輝等, 2001), 作為消化吸收效率更高的蛋白質水解產物, 不僅可應用于食品和飼料行業, 而且還可應用于疾病的防治, 為維護人類的健康作出貢獻(Morimuraet al, 2002)。

由于魷魚肝臟中蛋白質分解后的氨基酸組成有較大的差別, 沒有一個完整的模式可以探尋, 導致氨基酸小肽的分離難度較大。為此, 針對魷魚肝臟蛋白氨基酸的特點, 建立一套適合魷魚肝臟中降血壓活性肽的分離技術就顯得尤為必要(陳吉球, 1997; 吳建平等, 1998; 趙海珍等, 2004)。傳統常用的分離技術主要包括膜分離技術, 微濾技術, 高效液相色譜技術等等(何海倫等, 2004)。而在進行抑制肽的分離提取方面, 一般采用幾種方法相結合(文允鎰, 1996; 薛向陽等, 2004)。從魷魚肝臟中可以提取出消化吸收率更高的蛋白質水解產物, 提取的活性肽可以用作癌癥等疾病的治療, 為人類的醫藥事業做出了巨大貢獻(Erd?set al, 1987; Liet al, 2004)。本研究利用魷魚肝臟蛋白為原料, 采用各種分離純化技術提取出降血壓活性肽等物質, 為魷魚肝臟在保健食品和藥品等方面的應用提供了理論依據(Linzet al, 1995; Voorset al, 1998), 研究成果將實現魷魚肝臟等廢棄物得以綜合利用, 減少大氣環境污染, 具有重要的研究意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料與試劑: 冷凍魷魚肝臟, 由舟山興業集團公司提供, 放置于低溫冰箱冷凍保存, 保存溫度為–18°C。ACE 酶、特丁基對苯二酚(TBHQ)、底物Hip-His-Leu、丙酮、硼酸鹽緩沖液(pH 8.3)、TFA溶液、甲醇、茚三酮、濃鹽酸、胃蛋白酶、乙腈等。

實驗設備: 高效液相色譜儀 LC600(南京科捷分析儀器有限公司)、分析天平AL104、超濾器labscale、酶解罐、pH計、高溫爐、冷凍離心機 CF16RX、紫外檢測儀、超級恒溫水浴鍋等。

1.2 酶解條件的優化

在(36±1)°C, pH 2.0, 加酶量為 2%, 底物濃度為2.5%的條件下, 研究酶解時間對魷魚肝臟蛋白水解的效果, 測定ACE活性肽的含量。

酶解底物濃度的確定: 在溫度為 36°C, pH 2.0,酶與底物的比為 2%的條件下, 研究酶解時間對魷魚肝臟蛋白水解的效果, 測定ACE活性肽的含量。

酶制劑添加量的確定: 在溫度為 37°C, pH 2.0,底物濃度為 2.5%的條件下, 研究酶解時間對魷魚肝臟蛋白水解的效果, 測定ACE活性肽的含量。

1.3 酶解液的制備

將魷魚肝臟和水分按照1︰3的比例要求進行混合, 在混合過程中通入氮氣, 防止其被氧化變質, 同時加入適量的抗氧化劑 BHA, 放入高壓鍋(121°C,0.5Mpa)中處理20min后, 在5000 r/min的條件下離心15min, 去掉最上層的魚油后, 用丙酮進行處理, 真空干燥后獲得魷魚肝臟蛋白, 后添加 2%的胃蛋白酶酶解20h, 酶解的條件為底物濃度2%、酶解溫度36°C及酶解 pH 2.0。最后酶解終止, 以 90°C 條件保持15min為佳, 除去分子量高于20kDa以上的產物。收集水解產物后置于4°C冰箱中保藏。

1.4 抗壓肽抑制活性的測定

參考Cheung和Cushman介紹的方法對抗壓活性肽的抑制活性進行測定(Cushmanet al, 1971)。

ACE抑制率(%)=(對照品種馬尿酸的峰面積–樣品中馬尿酸的峰面積)/對照品種馬尿酸的峰面積×100%

1.5 蛋白酶解液水解度的測定

取酶解液稀釋處理后加入緩沖溶液, 在水浴鍋中加入處理20min, 在280nm下測光密度值。以蒸餾水做對比, 在上述波長下進行光密度的測定, 將去掉空白后的光密度帶入標準曲線算出蛋白質含量, 水解度(DH%)的計算公式如下:

式中:A為蛋白質含量(mg),W為樣品重量(g),V1為水解液的總體積(mL),V2為顯色時所用稀釋液體積(mL)。

1.6 降血壓活性肽抑制肽的分離及抑制活性分析

采用超濾對酶解液中的分子進行處理, 主要截留分子量為20kDa以上的分子, 將收集到的超濾液保藏于4°C備用。然后采用Sephadex G-100對超濾液進行分離, 提取抗壓活性肽, 并測定其活性。同樣地,用上述凝膠柱對超濾凍干樣品配成的溶液進行分離,蒸餾水洗脫, 流速為26滴/min, 在280nm波長下測定抗壓肽的活性。最后將具有降血壓活性肽的分子用DEAE陰離子交換柱分離。取適量超濾樣品用蒸餾水洗脫, 用0—1 mol/L NaCl溶液線性洗脫, 流速26滴/min,并測定各降血壓活性肽活性。最后取活性最高的活性肽用Sephadex LH-20繼續分離, 洗脫液為30%的甲醇溶液, 流速16滴/min, 并測定各降血壓活性肽活性。

2 結果與討論

2.1 胃蛋白酶酶解魷魚肝臟蛋白的優化

2.1.1 底物濃度對蛋白酶解效果的影響 由圖 1可知, 在底物濃度為 1.0%—2.5%的范圍時, 隨著底物濃度的增加, 蛋白酶水解度也逐漸增大, 而當底物濃度在2.5%—10.0%的范圍時, 底物濃度的上升反而使得蛋白酶水解度降低, 可能的原因是, 底物的增多使得蛋白酶像被包裹起來一樣, 與底物接觸就越發變得困難, 從而降低了水解度。從圖1中還可以看出,底物濃度對 ACE的抑制率并沒有太大的影響, 同時考慮水解度和對 ACE的抑制率, 將底物濃度確定為2.5%。

圖1 底物濃度對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.1 Influence of substrate concentration density on hydrolysis degree and ACE inhibitory activity

2.1.2 酶解時間對酶解效果的影響研究 反應時間為 2—22h時, 隨著酶解時間的增加, 蛋白水解度也逐漸增大(圖2), 超過22h后, 隨著酶解時間的延長,蛋白水解度的增加趨勢有所降低, 增加得更慢了; 從圖 3中還可以看出, 酶解時間對 ACE的抑制率沒有顯著性的影響, 同時考慮水解度和 ACE的抑制率,將酶解時間確定為22h。

圖2 酶解時間對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.2 Influence of enzymolysis time on hydrolysis degree and ACE inhibitory activity

圖3 酶與底物比對水解度和ACE抑制活性的影響Fig.3 Influence of ratio of enzyme and the substrate on hydrolysis degree and ACE inhibitory activity

2.1.3 酶與底物比對蛋白酶解效果的影響 從圖3可知, 當酶與底物比在 0%—2%的范圍時, 水解度與酶和底物比的變化呈正相關, 而酶和底物比在2%—5%時, 水解度隨著酶和底物比的升高增加的速度有所降低, 這是因為酶濃度越高, 其與蛋白質接觸的可能性越高, 底物就越容易轉化成底物肽。由圖 3也可看出, ACE抑制率受酶與底物比的影響不明顯,綜合考慮二者, 將酶與底物比確定為2%。

2.2 降壓活性肽的初步分離

采用 Sephadex G-100初步分離魷魚肝臟蛋白酶解液, 出現5個峰值, 如圖4所示峰值組分一、組分二、組分三、組分四、組分五。對五個組分分別進行收集、真空濃縮、冷凍干燥, 并測定每個組分的抑制活性。

如表1所示, 組分一、組分二、組分三洗脫下來的蛋白具有降血壓抑制活性, 其 IC50分別為: 2.28、1.92、5.02mg/mL。結果表明: 分子量較大的多肽, 其ACE抑制活性較好。選取粗分物中活性最高的組分(組分二), 對ACE抑制活性相關參數進行分析。

圖4 酶解液在Sephadex G-100上的洗脫峰值Fig.4 Hydrolyzate in Sephadex G-100 on the elution diagram

表1 Sephadex G-100初步分離各組分ACE抑制活性和回收率Tab.1 The ACE inhibitory activity and returns-ratio of various components initially separated by Sephadex G-100

2.3 組分二中降血壓肽抑制活性分析

2.3.1 組分二的理化穩定性考察研究 對魷魚肝臟蛋白用Sephadex G-50洗脫后得到的粗分物組分二的理化穩定性進行考察。圖5、圖6分別為不同溫度和不同 pH對組分二的 ACE抑制活性的影響。結果顯示, 組分二的溶液在溫度 0—100°C、pH 值 1—12之間對ACE的抑制活性基本沒有變化, 比較穩定。

圖5 溫度對組分二抑制活性影響Fig.5 Temperature on the inhibitory activity of Component 2

2.3.2 模擬胃腸環境消化實驗 ACE抑制肽在被人體攝入以后要經過胃腸消化道才能被吸收, 因此有必要研究模擬胃腸消化對組分二的 ACE抑制活性的影響。在本實驗中, 選擇組分二的樣品濃度為1.80 mg/mL, 模擬消化實驗, 檢測各酶解反應后酶解液的ACE抑制活性, 結果如表2所示。

從表 2中可以看出, 粗分物組分二的 ACE抑制活性在經過胃蛋白酶消化2h后, ACE抑制活性有一些提高, 但總體來說, 模擬胃腸消化對 ACE抑制活性的影響不大, 粗分物組分二經過胃腸消化后仍具有較高的ACE抑制活性。

圖6 pH對組分二的抑制活性影響Fig.6 pH on the inhibitory activity of Component 2

2.4 DEAE陰離子交換柱分離純化ACE抑制肽

選擇用適合生物大分子等物質分離的 DEAE陰離子交換柱對組分二分離純化, 洗脫得到了兩個峰值, 分別標注為組分六和組分七, 見圖 7。其中第 1個峰值處顯示抑制 ACE的活性較高, 且回收率高,標記為組分六。繼續收集組分六。通過 Sephadex LH-25繼續分離, 洗脫得到2個峰, 標記為組分八和組分九, 其半抑制濃度(IC50)分別為 1.58mg/mL和2.12mg/mL, 如圖8。檢測這兩部分的ACE抑制活性,結果表明ACE的抑制活性大致相同。

表2 模擬胃腸消化對組分二的ACE抑制活性的影響Tab.2 Influence of simulated gastrointestinal digestion on the ACE inhibitory activity of Component 2

圖7 粗分物組分二在DEAE陰離子交換柱上的洗脫圖Fig.7 The elution diagram of crude components of Component 2 on DEAE anion exchange column

圖8 組分六在Sephadex LH-20上的洗脫圖Fig.8 The elution diagram of Component 6 in Sephadex LH-20

3 結論

本文對魷魚加工下腳料進行綜合利用研究, 將提取魚油后的魷魚肝臟蛋白用丙酮處理除脂, 選擇蛋白酶進行酶解, 將酶解液進行超濾處理后, 跟蹤其ACE抑制活性, 應用凝膠過濾層析等方法分離純化ACE抑制肽。主要結論如下: (1) 將魷魚肝臟蛋白的酶解液經過截留分子質量為 20kDa的濾膜經過超濾處理后, 用 Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱初步分離,洗脫得到 5個洗脫峰, 其中粗分物組分二的 ACE抑制活性較高, 其IC50為1.92 mg/mL。(2) 對粗分物組分二的 ACE抑制活性相關參數分析, 結果表明: 組分二的溶液在溫度0—100°C、pH 1—12之間對ACE的抑制活性基本沒有變化, 比較穩定。而且模擬胃腸消化實驗對粗分物組分二的ACE抑制活性的影響不大, 經過胃腸消化后仍具有較高的ACE抑制活性。(3)用DEAE陰離子交換柱和Sephadex LH-20對組分六繼續分離純化, 分離得到為組分八和組分九, 其半抑制濃度(IC50)分別為1.58mg/mL和2.12mg/mL。

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