基于產品質量分析的中國倉鼠卵巢細胞流加培養工藝的優化

劉金濤+范里+鄧獻存+劉旭平+譚文松

摘要：在前期建立的流加培養工藝的基礎上，考察培養過程中的pH值對流加培養過程的影響，明確了過程控制參數pH值與產品關鍵質量屬性（critical quality attributes，CQAs）間的聯系，建立了產物質量屬性和過程操作屬性間的關系，并確認pH值為抗體融合蛋白生產工藝中的關鍵控制參數。結果表明，流加培養過程隨著培養pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學活性呈一定程度的下降趨勢，但唾液酸含量卻呈明顯的上升趨勢;此外，在pH值6.9和pH值7.0的條件下培養過程中的最大細胞密度、活力、蛋白表達量均優于其他條件，確定6.95±0.05為過程的控制pH值。將此培養工藝放到大200 L中試生產規模，結果與2 L反應器的結果基本一致。

關鍵詞：CHO細胞;pH值;抗體融合蛋白;流加培養;產品質量

中圖分類號： Q813.1+1 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0047-03

收稿日期：2014-12-21

基金項目：國家自然科學基金（編號：21106045）。

作者簡介：劉金濤（1987—），男，山東臨沂人，博士研究生，主要從事動物細胞大規模培養研究。E-mail：jtliu0416@gmail.com。

通信作者：譚文松，教授，博士生導師，主要從事動物細胞大規模培養研究。E-mail：wstan@ecust.edu.cn。

抗體藥物由于具有靶點明確、臨床療效顯著、副作用少等優點已成為當今生物醫藥產業發展的主流，其中動物細胞大規模培養技術是生產抗體藥物最主要的技術手段?！百|量可控，安全有效”是藥品研發過程中應首要遵循的原則，美國FDA在21世紀現行優良生產規范（current good manufacturing practices，cGMPs）中提出的一個關鍵要素就是質量源于設計（quality by design，QbD）[1]。因此在工藝開發中始終貫徹QbD原理，設計不同的參數控制范圍來設計產品的質量，使得產品質量始終處于可控狀態，對加快藥品開發有著十分重要的意義[2]。

前期我們關于培養溫度對細胞生長和產物表達影響及機制進行了深入的研究和探討[3-4]，而培養過程中的另一關鍵控制參數——pH值對細胞生長和表達有著重要作用[5]。一方面由于pH值在搖瓶、孔板等小規模培養高通量系統中難以進行有效的檢測和控制，導致在放大到反應器規模時則會出現產品質量不可控制的狀態;另一方面細胞在培養過程中乳酸等代謝副產物的大量生成導致培養體系中的pH值發生較大變化，須要通過補酸或補堿的方式維持pH值的穩定。因此在反應器中系統研究pH值對于細胞生理狀態特別是產物質量的影響是保證生產過程中產品質量可控的一項必不可少的工作。

本研究以表達抗體的融合蛋白的重組中國倉鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）細胞為研究對象，以抗體融合蛋白關鍵質量參數為主要評價標準，同時結合細胞生長、代謝和產物表達情況，在2 L生物反應器中對流加培養過程中的操作參數pH值進行了詳細的考察，通過綜合分析確定最適pH值，并成功地將該工藝穩定地放大到中試生產規模。

1 材料與方法

1.1 細胞株和培養基

試驗細胞株為表達抗體融合蛋白的重組CHO細胞?；A培養基為商業Excell 302培養基（SAFC），流加培養基為筆者實驗室自主開發[6]。培養基經0.22 μm微孔濾膜（millipore）過濾除菌，保存于4 ℃冰箱。培養基配制所用試劑均購自Sigma-Aldrich公司。

1.2 細胞培養

從細胞庫中復蘇重組CHO細胞，以（2～3）×105 個/mL活細胞密度接種于搖瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養，轉速為120 r/min，作為試驗用的種子細胞。取對數生長期的CHO細胞，以約1.0×106 個/mL的活細胞密度接種至反應器中，培養體積為1.5 L。培養過程中每24 h取樣，計數。培養液經10 000 r/min離心10 min后取上清于-20 ℃保存，用于試驗結束后營養物、代謝副產物、抗體融合蛋白的檢測。培養過程均使用Sartorius公司生產的2 L BIOSTAT A-plus 細胞反應器。培養時反應器操作條件：溶解氧為50%，溫度為 37 ℃，攪拌轉速為150 r/min，pH值分別控制在6.8、6.9、70、7.2條件下（無控制作用區設為±0.02）。pH值的控制采用深層通入CO2或者補入1 mol/L NaOH 溶液的方式。流加策略采用葡萄糖控制模型[6]。

1.3 分析方法

細胞密度和活力采用Bio-Rad TC20TM 自動計數儀，葡萄糖、乳酸、氨的檢測采用 NOVA Bioprofile 400;產物濃度的檢測采用 Protein A-HPLC （Applied Biosystems）的方法，方法參照文獻[7]。上清收獲后采用rProtein A親和層析柱（GE Healthcare）純化并收集抗體。唾液酸含量根據《中華人民共和國藥典》（2010年版3部）中唾液酸檢測方法測定。生物學活性的測定方法同文獻[8]。多聚體的檢測采用凝膠排阻色譜（SEC）的方法，色譜柱為TSK-Gel G3000 SWXL （4.6 mm×30 cm，Tosoh Bioscience），方法參見文獻[9]。

2 結果與分析

2.1 pH值對于細胞生長和代謝的影響

2.1.1 pH值對細胞生長的影響 通過在不同pH值培養條件（6.8、6.9、7.0、7.2）下的對比試驗可知，在pH值6.8條件下，CHO細胞直接進入指數生長期，快速生長達到最高細胞密度 8.6×106 個/mL，隨后活細胞密度顯著降低（圖1）。pH值6.9 和pH值7.0的條件下，細胞生長情況與pH值6.8條件下類似，但最高活細胞密度達到1.01×107 個/mL，并且至培養結束時細胞仍維持較高的活力（大于90%）。而在pH值7.2的條件下最高活細胞密度僅為5.8×106 個/mL，隨后活細胞密度和細胞活力快速下降，培養僅維持9 d，培養結束時細胞活力僅為45.7%。

2.1.2 pH值對主要營養物表達的影響 葡萄糖是細胞生長代謝所需的重要碳源和能源物質，為了維持培養基中的葡萄糖濃度，防止葡萄糖耗竭所引起的細胞代謝的變化[10]，流加策略采用葡萄糖控制模型。由表1可知，在細胞生長階段（0～5 d）各培養過程的葡萄糖比消耗速率無明顯差異。而產物表達階段（6～12 d），pH值控制在7.2的培養過程葡萄糖的比消耗速率依然維持在一個較高的水平，為1.8 mmol/（109cells·d），是其他培養過程的3.3～3.8倍。

乳酸和氨是細胞代謝的2個主要副產物，在培養基中的大量累積會嚴重影響細胞的生長和產物的表達[11-12]。與其他培養過程中出現乳酸代謝轉變現象不同，pH值為7.2的培養過程乳酸仍一直處于生成狀態，培養結束時培養基中的乳

表1 流加培養過程中主要營養物及代謝副產物比消耗（生成）速率

pH值

比消耗速率[mmol/（109cells·d）]

葡萄糖 乳酸 氮

0～5 d 6～12 d 0～5 d 6～12 d 0～5 d 6～12 d

6.8 -2.40 -0.54 1.75 -0.43 0.44 0.27

6.9 -2.25 -0.50 2.05 -0.24 0.42 0.12

7.0 -2.35 -0.47 1.98 -0.08 0.49 0.05

7.2 -2.31 -1.80 2.61 0.82 0.45 0.054

注：負值代表消費。

酸濃度達到了44.8 mmol/L，是其他過程的1.48～3.33倍（圖2-A）。培養過程中乳酸的大量累積可能是導致pH值為7.2時培養過程活細胞密度和細胞活力快速下降的主要原因。與乳酸代謝相似，氨代謝也在培養至4 d出現了顯著的區別（圖2-B）。氨在pH值為6.9～7.2的培養過程進行到4 d后累積速率顯著降低，以pH值為7.0的培養過程為例，氨比生成速率從0.49降低至0.05（表1），而pH值為6.8的培養過程氨依然大量累積，培養結束時氨濃度達到 17.7 mmol/L。

2.2 pH值對抗體融合蛋白表達以及產品質量的影響

2.2.1 pH值對抗體融合蛋白表達的影響 由表2可知，在pH 值7.2條件下，由于細胞生長和維持不利，抗體融合蛋白的最高濃度僅為0.32 g/L，僅是pH值在7.0培養過程的24%。對比不同條件下抗體融合蛋白的比生成速率，pH值7.2條件下抗體融合蛋白比生成速率與pH值7.0培養過程相比分別下降了63.1%、20.7%。

2.2.2 pH值對抗體融合蛋白唾液酸含量的影響 唾液酸廣泛存在于糖蛋白N-糖鏈或O-糖鏈的末端，研究表明，蛋白類藥物中唾液酸含量對于藥物在體內的半衰期有著重要的影響[13]。因此抗體融合蛋白的唾液酸化程度是衡量藥用蛋白質量的一個重要指標。在不同pH值培養條件下抗體融合蛋

表2 pH值對抗體融合蛋白生成的影響

pH值 表達量

（g/L） 蛋白比生成速率

[pg（cell·d）]

6.8 0.90 17.8

6.9 1.28 17.2

7.0 1.35 17.9

7.2 0.32 14.2

白的唾液酸含量見圖3-A，可見隨著培養pH值的降低抗體融合蛋白的唾液酸含量呈明顯下降趨勢，在pH值6.8條件下的唾液酸含量僅為pH值7.0條件下的73.5%。研究結果表明，降低培養過程中的pH值能夠顯著抑制抗體融合蛋白的唾液酸修飾。Gawlitzek等在研究氨對TNFR-Fc影響時發現，提高培養基中氨的濃度（15 mmol/L）能顯著降低蛋白的唾液酸含量[14]。研究還表明，降低培養pH值能使氨的比生成速率顯著提高，這可能是在pH值6.8條件下唾液酸含量下降的主要原因。

抗體融合蛋白的生物學活性是評價產品生物學性質的一個重要指標。隨著培養過程中pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學活性呈明顯下降趨勢。在pH值7.2的條件下，抗體融合蛋白的生物學活性僅為pH值7.0條件下的45.1%（圖3-B）?？赡苁怯捎谂囵BpH值改變引起了胞內pH值的改變，影響了抗體融合蛋白的加工和修飾過程中酶活性的變化，從而影響了蛋白的翻譯后修飾。

2.2.3 pH值對抗體融合蛋白多聚體含量的影響 重組蛋白的聚合是影響重組蛋白質量、安全的主要因素之一，不僅影響其生物學功能，而且有可能在體內引起免疫反應[15]。不同pH值條件下培養液中抗體融合蛋白單體和多聚體的含量見表3。結果表明，pH值為6.9的培養過程抗體融合蛋白多聚體含量最低，僅為5.87%，升高或降低pH值水平多聚體含量略有增加?？紤]到多聚體的含量仍處于較高水平，可以進一步優化培養工藝或者通過下游純化的方法來進一步降低多聚

表3 不同pH值條件下抗體融合蛋白多聚體含量

pH值

融合蛋白（%）

多聚體 單體

6.8 7.51 92.49

6.9 5.87 94.13

7.0 6.59 93.41

7.2 7.89 92.11

體的含量。

2.3 流加培養工藝的優化及放大

通過研究，明確了過程控制參數pH值與產品關鍵質量控制參數唾液酸、多聚體含量、產物生物學活性間的聯系，建立了產物質量屬性和過程操作屬性間的關系，確認pH值為抗體融合蛋白生產工藝中的關鍵控制參數。研究結果表明，隨著培養pH值的提高，抗體融合蛋白的生物學活性呈一定程度的下降趨勢，但是抗體融合蛋白的唾液酸含量卻呈明顯的上升趨勢。在pH值6.9和pH值7.0的條件下，培養過程中的最大細胞密度、活力以及蛋白表達量均優于其他條件。綜合考慮抗體融合蛋白的各個質量指標、細胞的生長和表達情況以及反應器控制時pH值的波動問題，在培養過程中pH值應該控制在6.95±0.05。超過此范圍特別是pH值水平偏高達7.2時，細胞生長受到抑制且維持不利，乳酸大量生成，關鍵質量控制參數唾液酸和產物活性均有不同程度的降低。

通過培養pH值的優化，并將流加培養工藝放大到30 L和200 L規模的反應器，表現結果與2 L反應器下的結果基本一致。

3 結論

在前期流加培養工作的基礎上，通過考察流加培養過程中培養pH值對細胞生長、代謝與產物合成以及產物各質量參數的影響，結果表明：（1） 在pH值6.9和pH值7.0的條件下，最大細胞密度和細胞活力以及抗體融合蛋白的表達量均高于其他培養條件;（2） 培養過程中的pH值對細胞的乳酸或氨代謝有較顯著的影響;（3） 提高培養過程中的pH值，抗體融合蛋白的生物學活性呈顯著下降趨勢，而抗體融合蛋白的唾液酸含量卻呈上升趨勢。

將細胞生長、代謝、表達以及抗體融合蛋白的各質量參數綜合比對分析，確定6.95±0.05為過程的控制pH值，并成功放大到30 L和200 L反應器規模。試驗還發現抗體融合蛋白的多聚體含量仍處于較高的水平，可以進一步通過優化培養基、改變培養參數或者下游分離純化等方法降低抗體融合蛋白的多聚體含量。

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