施肥及種植密度對大豆根瘤類菌體產生的影響

楊名方+張崇玉+付責中+秦仕華

摘要：通過大田試驗，以探明大豆根瘤類菌體生長隨播種時間的變化趨勢，以及施用有機肥作為基肥、配施鉬肥和鐵肥與大豆種植密度等因素對大豆根瘤菌產生的影響。結果表明，在播種后40～90 d，大豆根瘤菌粒數、鮮質量和干質量均隨播種時間呈先增加后降低的趨勢，其最大值均出現在播種后70 d左右，此時大豆剛剛進入結莢期;有機肥作為基肥對根瘤菌的產生影響最大，其后依次是鉬肥、種植密度、鐵肥;根瘤菌產量最高的組合是不施有機肥與鉬肥，鐵肥施肥量為150 g/hm2，大豆撒播密度為1.5×107 株/hm2。

關鍵詞：大豆;根瘤菌;播種時間;鉬肥;鐵肥;種植密度

中圖分類號： S565.104;Q945.13 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0105-03

收稿日期：2014-10-06

作者簡介：楊名方（1987—），女，碩士，從事施肥原理與養分管理研究。E-mail：461810510@qq.com。

通信作者：張崇玉，博士，教授，從事植物營養與環境科學研究。E-mail：zhcy600116@sina.com。

生物固氮是指固氮微生物將空氣中游離態的氮素轉變為氨態氮，并能被植物吸收利用的過程。目前，人類對豆科植物的共生固氮利用空間還很大[1]，如何使非豆科植物特別是主要糧食作物具有固氮作用更是人們正在努力探索的方向[2]，原生態根瘤菌產品的工業化具有廣闊的市場前景。對根瘤類菌體產生的適宜條件開展研究，可以增強人們對生物固氮的認識，對通過種植原生態大豆為微生物肥料生產提供大量優質的原始根瘤菌群具有重大意義[3]。

在大豆-根瘤共生體系中，根瘤為大豆提供了氮源，同時可從寄主植株吸收養分供自身生長。有研究表明，通過施肥等方式可使寄主植物地上部分營養供應增加、新陳代謝增強，但同時也減少了光合產物向地下部分運輸，影響了根瘤的生長[4]。固氮酶能讓固氮微生物在常溫下將氮氣分子轉化為氨，并可進一步分化為鉬鐵蛋白和鐵蛋白2個大小不同的深褐色蛋白，且只有在2個蛋白處于結合狀態的時候才具有催化活性，鉬鐵元素對固氮酶具有十分重要的作用。氧氣對固氮酶極易產生不可逆轉的破壞，既破壞固氮酶的活性，又破壞固氮酶的生物合成，對生物固氮本身非常有害，固氮酶中的鐵蛋白對氧尤其靈敏[5]。

在寄主豆科植物幼苗長出2～3片真葉時，根瘤菌首先進入根毛，經過1條“侵入線”進入皮層細胞并立即被質膜包圍，在形成的包膜中繁殖、發育為成熟的類菌體。在這個系統中，豆血紅蛋白、膜和末端氧化酶系統共同創造了一個既能保護固氮酶的活力，又能有效利用的低濃度氧環境，使生物固氮能夠在類菌體中進行[6]。本試驗通過施用有機肥作為基肥提供氮、磷、鉀等主要營養元素，施用不同質量的鉬肥和鐵肥，設置不同的大豆種植密度以影響寄主植株的通風透光性等，觀察和分析根瘤類菌體的產生情況，并通過正交試驗，獲得根瘤類菌體產生條件的優化組合。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況與試驗材料

試驗在貴州大學農學院松林坡試驗地（SLP）大田進行，土壤pH值為7.65，全氮、有機質含量分別為1.97、18.26 g/kg，堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別為11.2、30.1、407.24 mg/kg;選取貴陽市花溪區農戶自留的大豆種為試材，以撒播方式進行種植。大豆基肥為實驗室專用有機肥，其養分含量為全氮0.92%、有效磷（P2O5）2.69%、有效鉀（K2O）0.98%;鉬酸銨試劑由洛陽歐瑞冶金科技有限公司生產，氧化鉬含量為83.19%，用以配制鉬肥;硫酸亞鐵由天津市永大化學試劑有限公司生產，硫酸亞鐵含量為99.0%，用以配制鐵肥。

1.2 試驗設計

1.2.1 根瘤菌收獲時間的篩選 對根瘤菌收獲時間的篩選采用單因素試驗，不施用任何肥料，大豆種植密度為1.5×107 株/hm2。重復3次。

1.2.2 施肥因素與種植密度的篩選 根據大豆根瘤菌生長所需營養元素和大豆生長對種植密度的要求[7]，選取有機肥（A）、鉬肥（B）、鐵肥（C）、種植密度（D）為考察因素，按照 L9（34） 正交表（表1）進行試驗，共計9個處理，每處理重復3次。有機肥和鉬肥在播種前撒施，鐵肥于大豆播種25 d左右噴施于葉面上[8]。

1.3 試驗處理

每1小區為1個處理，面積為3 m2（2 m×1.5 m）。大豆于4月20日播種，播后40 d開始采樣，至播后90 d止，每隔4～5 d采樣1次，采樣時，每個小區隨機選取大豆10株，根部隨同泥土一起迅速帶回實驗室進行處理，以根瘤菌粒數、鮮質量、干質量作為測試指標，記錄數據。正交試驗以播后70 d的根瘤菌粒數和干質量各50%權重進行計算來作為根瘤菌的產量。

1.4 數據統計及分析

采用Excel 2007和DPS軟件進行統計和數據分析。

表1 L9（34）正交試驗設計表

處理 A：有機肥

（t/hm2） B：鉬肥

（g/hm2） C：鐵肥

（g/hm2） D：種植密度

（×106株/ hm2） 代號

1 0 0 0 5 A1B1C1D1

2 0 150 150 15 A1B2C2D2

3 0 300 225 25 A1B3C3D3

4 1.3 0 150 25 A2B1C2D3

5 1.3 150 225 5 A2B2C3D1

6 1.3 300 0 15 A2B3C1D2

7 2.6 0 225 15 A3B1C3D2

8 2.6 150 0 25 A3B2C1D3

9 2.6 300 150 5 A3B3C2D1

2 結果與分析

2.1 播種時間對大豆根瘤菌粒數和質量的影響

根瘤菌與大豆形成共生關系，其產生的瘤數、質量均會隨大豆生理周期的變化而發生變化。由圖1可知，隨播種天數的增加，根瘤菌的粒數呈現先增加后降低的趨勢;在播后40～50 d，根瘤菌粒數呈上升趨勢，50～60 d，根瘤菌粒數變化比較平穩;60～70 d粒數再次增加，在70 d時達到最大值;70～90 d，結瘤數逐漸減少。

由圖2可知，根瘤菌的質量隨播種時間的變化趨勢與粒數相似，在播種40～70 d不斷增加并達到最大值，70～90 d逐漸下降;鮮質量的變化幅度大于干質量的變化幅度。

在大豆-根瘤共生體系中，大豆與根瘤菌的共生固氮作用所固定的氮素占大豆一生需氮量的50%～60%[9]，而根瘤的生長需要依靠寄主植物提供養分才能完成。從大豆的生長周期來看，在播后70 d左右大豆處于結莢期，并從營養生長進入生殖生長階段，此時，根瘤菌的活性逐漸降低;播后90 d，大豆種子進入成熟期，植株逐漸枯萎，根瘤體系也隨之消亡[10]。隨著活性的降低，根瘤菌群抵抗外界干擾的能力降低，會受到土壤中其他微生物的侵襲，出現大量壞爛和空殼的現象。因此，在大豆開始結莢以后，根瘤菌的數量和質量均呈現減少和下降的趨勢。由此可見，為了獲得較高產量的根瘤菌，需在大豆剛剛開始進入生殖生長的時期進行收集。

2.2 正交試驗

2.2.1 正交試驗各因素重要性分析 由表2、表3、表4可知，最優組合為A1B1C2D2，即不施用有機肥和鉬肥，鐵肥施肥量為150 g/hm2、大豆種植密度為 1.5×107株/hm2;試驗因素主次順序為：A>B>D>C，即影響因素最大的是有機肥作為基肥的施肥濃度，其次是鉬肥、大豆種植密度，影響因素最小的是施用鐵肥濃度。

表2 大豆施肥因素與種植密度等正交試驗結果

小區代號

根瘤菌粒數（粒） 根瘤菌干質量（g）

重復1 重復2 重復3 重復1 重復2 重復3

A1B1C1D1 157 153 128 0.878 3 0.965 5 0.827 9

A1B2C2D2 145 163 149 0.773 9 1.321 5 0.989 2

A1B3C3D3 79 92 71 0.483 0 0.567 3 0.526 4

A2B1C2D3 81 80 72 0.470 3 0.576 6 0.331 7

A2B2C3D1 70 110 82 0.560 6 0.698 0 0.537 7

A2B3C1D2 46 42 62 0.280 2 0.294 7 0.475 1

A3B1C3D2 83 66 57 0.524 6 0.517 3 0.500 7

A3B2C1D3 27 51 34 0.294 7 0.361 4 0.337 9

A3B3C2D1 37 55 52 0.174 5 0.383 6 0.324 1

表3 不同施肥及種植密度下根瘤菌的產量與極差分析

試驗小區 有機肥

（t/hm2） 鉬肥

（g/hm2） 鐵肥

（g/hm2） 種植密度

（株/hm2） 干質量

（g） 粒數

（粒） 綜合

評分

A1B1C1D1 1 1 1 1 0.891 146 73.445

A1B2C2D2 1 2 2 2 1.028 152 76.581

A1B3C3D3 1 3 3 3 0.526 81 40.596

A2B1C2D3 2 1 2 3 0.460 78 39.063

A2B2C3D1 2 2 3 1 0.599 87 43.966

A2B3C1D2 2 3 1 2 0.350 50 25.175

A3B1C3D2 3 1 3 2 0.514 69 34.590

A3B2C1D3 3 2 1 3 0.331 48 24.166

A3B3C2D1 3 3 2 1 0.294 37 18.647

k1 63.541 49.033 40.929 45.353

k2 36.068 48.238 44.764 45.449

k3 25.801 28.139 39.717 34.608

R 37.740 20.894 5.047 10.841

注：統計分析使用LSD分析法。

表4 正交設計試驗大豆根瘤菌產量方差分析

方差來源 偏差平方和 自由度 F值 P值

A：有機肥 2 284.441 2 2.687 >0.05

B：鉬肥 841.106 2 0.989 >0.05

C：鐵肥 41.640 2 0.049 >0.05

D：種植密度 232.963 2 0.274 >0.05

試驗結果表明，不施用有機肥比施用1.3、2.6 t/hm2有機肥的根瘤菌產量分別高出76.2%和150.9%;施用 150 g/hm2 鉬肥的大豆根瘤菌產量比不施用鉬肥增加2.1%，比施用300 g/hm2鉬肥產量增加32.9%;大豆種植密度為 15×107株/hm2 時根瘤菌產量比種植密度為5×106株/hm2時增產2.2%，比2.5×107株/hm2增產31.3%。鐵肥在大豆播后25 d左右噴施時遭遇雨水天氣，對正交試驗結果存在較大的誤差，沒有對其進行分析。

3 結論與討論

試驗結果表明，大豆收獲根瘤的最佳時間是播種后70 d左右，此時，大豆根瘤菌的粒數和質量均達到最大值。在實際生產中，由于大豆品種、生長特性、地理環境、氣候等因素的不同而導致播種時間會有所不同，可以通過形態觀察，在大豆植株剛開始進入結莢期、進入生殖生長時作為根瘤菌的最佳收獲期。大豆僅靠自身的固氮作用不能滿足豐產要求[11-12]，需要通過施用有機肥為大豆生長補充氮、磷、鉀等主要營養元素。

氮元素對豆科植物生物固氮的共生體系產生重大影響[13-21]。在供試土壤條件下，為獲得較高產量的大豆根瘤菌，種植大豆過程不需要施用肥料，土壤中的營養物質可通過大豆吸收來滿足根瘤菌的生長。施用有機肥可給大豆植株直接提供豐富的氮源，但使大豆對根瘤中固氮酶提供的氮源依賴性減小，根瘤與大豆的共生關系遭到破壞[10]。植物的磷吸收與根系形狀、結瘤數量、籽粒產量等均有密切關系[22-23];鉬、鐵是生物固氮體系的重要元素，對根瘤生長具有重大的意義[5，8，24]。只有在根瘤菌群中固氮菌數量和活性均處于較好狀態時，營養元素才能為根瘤的產量作出較大貢獻。

試驗結果表明，適宜大豆結瘤的最佳種植密度是 1.5×107株/hm2，約是通常大豆種植密度的1.5倍，這可能與根瘤菌群的需氧性有關。根瘤菌結瘤需要相對密封的狀態，通過適當密植，可以減少植株間的通風透光性，為根瘤菌的產生提供適當封閉的空間。同時，不施肥與適當密植，都適當減少了地上部分光合作用和呼吸作用的強度，使根瘤菌能夠從寄主植物獲得更多的營養物質供給菌群的生長，而種植密度過大，影響了大豆植物的正常生長，不利于根瘤的產生。通過種植大豆收獲根瘤的原始菌群，讓大豆接近“野生狀態”，利于根瘤菌類菌體的產生，可滿足工業化生產的較大需求，且操作簡便。

在本試驗中，鐵肥在噴施后受雨水天氣影響，結果存在較大誤差，有必要對鐵肥因素進行進一步驗證。同時，本研究只從根瘤菌的產量等相關方面進行了分析，還需要從根瘤菌的菌群種類和固氮菌所占比例及活性等進行分析比較，為篩選適宜根瘤菌生長的環境條件提供更全面的科學依據。

參考文獻：

[1]賀學禮，趙麗莉. 陜西豆科固氮牧草的生態學研究[J]. 中國草地，1997（2）：45-48.

[2]黃群策，陳啟鋒，李志真.生物固氮研究的前景[J]. 科技導報，1999（1）：23-25.

[3]吳建峰，林先貴. 我國微生物肥料研究現狀及發展趨勢[J]. 土壤，2002，34（2）：68-72.

[4]宋海星，王 萍，申斯樂，等. 大豆共生固氮與葉片全氮含量之間關系的研究[J]. 吉林農業科學，2000，25（6）：9-11.

[5]劉 錚. 微量元素的農業化學[M]. 北京：科學出版社，1991：142-170.

[6]洪國藩.生物固氮[J]. 科學，1985，37（1）：25-30.

[7]張立軍，陳艷秋，孫旭剛，等. 營養元素對大豆氮素營養及產量的影響淺析[J]. 大豆科技，2013（4）：59-63.

[8]王永鋒，裴桂英，馬賽飛，等. 鐵肥在大豆上的施用效果 Ⅰ.大豆基施鐵肥肥效研究[J]. 耕作與栽培，2006（2）：33-36.

[9]Ohwaki Y，Sugahara P. Active extrusion of protons and exudation of carboxylic acids in response to iron deficiency by roots of chickpea（Cicer arietinum L.）[J]. Plant and Soil，1997，189（1）：49-55.

[10]陳華癸，李阜棣，陳文新，等. 土壤微生物學[M]. 上海：上?？茖W技術出版社，1981.

[11]Demon C J，Sutherland P L. Soil-fertility requirement of soybeans with reference to irrigation[M]//Hurdy W H. Irrigated soybean production in arid and semi arid regions. University of Illinois，1979：276-352.

[12]Marscher H. Mineral nutrition of higher plant[M]. London：Academic Press，1986：674.

[13]Kennedy I R. Primary products of symbiotic nitrogen fixation. Ⅰ. Short-term exposures of serradella nodules to N2[J]. Biochem Biophys Acta，1966，130（2）：285-294.

[14]Sinclair T R，Serraj R. Legume nitrogen fixation and drought[J]. Nature，1995，378（23）：344-347.

[15]王樹起，韓曉增，喬云發，等. 施氮對大豆根瘤生長和結瘤固氮的影響[J]. 華北農學報，2009，24（2）：176-179.

[16]嚴 君，韓曉增，王守宇，等. 不同施氮量及供氮方式對大豆根瘤生長及固氮的影響[J]. 江蘇農業學報，2010，26（1）：75-79.

[17]房增國，左元梅，李 隆，等. 玉米-花生混作體系中不同施氮水平對花生鐵營養及固氮的影響[J]. 植物營養與肥料學報，2004，10（4）：386-390.

[18]Watababe T，Tabuchi K，Nakano H. Response of soybean to supplemental nitrogen after flowering[M]//Shanmugasundaram S，Sulzberger E W，Clean B T M. Soybean in tropical and subtropical cropping system. Shanhua，Taiwan，China：AVRDC，1986：308-310.

[19]甘銀波，本佳婉.不同氮肥管理對毛豆共生固氮及產量的影響[J]. 中國油料，1996（1）：34-37.

[20]Streeter J，Wong P P. Inhibition of legume nodule formation and N2 fixation by nitrate[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，1988，7（1）：1-23.

[21]Dakora D F. A functional relationship between leghaemoglobin and nitrogenase based on novel measurements of the two proteins in legume root nodules[J]. Annals of Botany，1995，75（1）：49-54.

[22]Bhuiyan M M H，Rahman M M，Afroze F，et al. Effect of phosphorus，molybdenum and rhizobium inoculation on growth and nodulation of mungbean[J]. Journal of Soil Nature，2008，2（2）：25-30.

[23]Murat E B，Yildirim，Enact T，et al. Effects of phosphorus application and rhizobium inoculation on the yield，nodulation and nutrient uptake in field pea（Pisum sativum sp. arvense L.）[J]. Journal of Animal and Veterinary Advances，2009，8（2）：301-304.

[24]Kaiser B N，Moreau S，Castelli J，et al. The soybean NRAMP homologue，GmDMT1，is a symbiotic divalent metal transporter capable of ferrous iron transport[J]. The Plant Journal，2003，35（3）：295-304.