外源水楊酸對棉花相關抗蟲酶活性誘導的時間和濃度效應

王燕芳+吳瑛

摘要：采用噴霧方法，初步探討外源水楊酸對棉葉總酚和抗蟲酶活性的誘導作用，結果表明，在適度濃度和時間范圍內，水楊酸（SA）能明顯誘導棉葉中總酚含量、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）活性和胰蛋白酶抑制力（TI） 活性的增加;5 mmol/L 水楊酸處理后4 d對棉葉總酚含量、PAL活性和胰蛋白酶抑制力的誘導作用最為顯著，水楊酸5 mmol/L處理后2 d和0.5 mmol/L 處理后4 d對棉葉PPO活性的誘導效果最優;隨著水楊酸處理時間的延長，水楊酸誘導棉葉總酚含量和抗蟲酶（PAL、PPO、TI）活性具有先升高后降低隨后又升高的特點。這說明外源水楊酸能在一定程度上提高棉花抗蟲相關的物質和酶活性以達到抗蟲目的。

關鍵詞：水楊酸;棉花;總酚;抗蟲酶;總酚含量;苯丙氨酸解氨酶;多酚氧化酶

中圖分類號： S562.01 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0138-03

收稿日期：2014-09-25

基金項目：國家自然科學基金（編號：20867005）。

作者簡介：王燕芳（1989—），女，山西忻州人，碩士，從事外源激素對棉花病蟲害防治研究。E-mail：819710681@qq.com。

通信作者：吳 瑛，教授，從事化學教學與研究。E-mail：wuyingjuyuan@163.com。

水楊酸（SA）作為植物的一種重要信號分子，能激活植物超敏反應，誘導病程相關蛋白基因（PR）的表達，使植物產生系統性防御，增強其抗病能力。有研究表明，水楊酸在誘導抗蟲方面也有重要作用[1-2]，如楊扇舟蛾取食受水楊酸甲酯（MeSA）熏蒸后的黑楊葉片后，成蟲對食物的消化吸收降低、發育歷程延長、死亡率增加[3];利馬豆遭二斑葉螨取食后，會釋放一種含有MeSA的揮發物以吸引二斑葉螨的天敵智利捕食螨，從而起到間接抗蟲作用[4]。 植物體內次生代謝產物含量和防御酶活性的變化是植物抗蟲過程中的重要表現，具有重要的防衛功能[5]。目前，關于棉花在外源水楊酸誘導作用下的相關抗蟲生理生化防御研究比較少，本試驗從植物生理生化防御角度出發，探討外源水楊酸不同濃度和作用時間下棉花體內相關抗蟲酚類次生代謝產物和蛋白酶活性的變化，以明確外源水楊酸對棉花的抗蟲誘導作用機制，為水楊酸在棉花生產上的科學利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

試供棉花種子中棉40，由新疆維吾爾自治區阿拉爾市農業科學研究所提供。將大小均勻且飽滿的種子撒播于10 cm×15 cm的塑料花盆中，每盆播種10粒，放置于重點實驗室組培室中培養，試驗用土為黃壤、蛭石、草木灰，按照 2 ∶ 2 ∶ 1 配比，經高溫滅菌、晾曬。棉花生育期確保有適宜的濕度和溫度、無病蟲害，光照時間為18 h/d。棉花1～2片真葉期間苗，留苗4株/盆;待長至4～5片真葉期，葉面噴施含有1% Tween20和6%乙醇的不同濃度水楊酸，分別為0.05、0.5、5 mmol/L，以含1%Tween20、6%乙醇的水溶液為對照（CK），直至水珠落下為準，透明塑料袋套袋，12 h后摘除;在噴施后0、2、4、6、8 d分別剪取真葉葉片，液氮封存，待測。每處理重復3次。

1.2 測定方法

酚酸含量的測定[6]：稱取0.1 g鮮葉，加入3 mL 95%乙醇研磨成勻漿;加入5 mL乙醇潤洗，定容至10 mL，2 500 r/min 離心5 min，取上清液得粗提液;移取1.25 mL粗提液到10 mL具塞試管中，加1 mL福爾馬林試劑搖勻，靜置4～5 min;加2 mL 10%Na2CO3，置75 ℃水浴鍋中保溫 10 min，分光光度計于765 nm處比色。

多酚氧化酶（PPO）活性的測定[7]：稱取鮮葉0.1 g，加入含7% PVP、濃度為0.1 mmol/L、pH值為7.4的磷酸緩沖液2.5 mL，于冰浴中研磨成勻漿;4 ℃下 5 500 r/min離心10 min，上清液即為酶液;移取0.1 mmol/L鄰苯二酚1.5 mL、酶液05 mL和磷酸緩沖液1 mL，420 nm處比色，測定2 min內吸光度的變化。

苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的測定[8]：稱取0.1 g鮮葉，加2.5 mL預冷的0.05 mmol/L、pH值為7.8的 Tris-HCl緩沖液和0.02 g PVP，于冰浴中研磨;4 ℃下 5 500 r/min離心 10 min;取0.2 mL上清液于5 mL試管中，加入3.8 mL Tris-HCl緩沖液和1 mL 0.6 mmol/L苯丙氨酸，40 ℃水浴1 h;加 0.2 mL 6 mmol/L HCl終止反應，290 nm處測吸光度。

胰蛋白酶抑制力（TI）活性的測定[9]：稱取0.1 g鮮葉，加2 mL Tris-HCl緩沖液，冰浴研磨成勻漿;4 ℃ 下5 000 r/min離心10 min;取0.1 mL上清液和0.02 mL胰蛋白酶抑制液混合，25 ℃水浴30 min;取0.1 mL水浴后的混合液與2.9 mL BAEE進行反應，256 nm處測定吸光度的變化。

1.3 數據處理

采用SPSS 20軟件單因素多重比較法，分析水楊酸對棉葉相關抗蟲酶活性誘導效應的差異性。

2 結果與分析

2.1 水楊酸對棉葉總酚含量的誘導效應

由圖1可見，隨著處理后時間的延長，棉葉總酚含量呈現上升趨勢，處理后4 d時棉葉總酚含量達到最大值，顯著高于對照，其中，5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉總酚含量均顯著高于其他濃度處理（P<0.05），是CK的1.55倍;處理后6 d，總酚含量降到最低，除5 mmol/L 水楊酸外，各濃度處理均低于對照;處理后8 d，棉葉總酚含量迅速回升，0.5 mmol/L和 5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉總酚含量均顯著高于CK。經單因素多重比較分析可得，除處理后0 d和2 d之間無顯著性差異（P=0.087）外，處理后其他時間的總酚含量均差異顯著;0.05 mmol/L 水楊酸與CK處理后的總酚含量無顯著性差異（P=0763）。水楊酸能明顯誘導棉葉總酚物質的產生，處理后4 d，5 mmol/L 水楊酸處理對棉葉總酚含量的誘導作用最大。endprint

2.2 水楊酸對棉葉PAL活性的誘導效應

由圖2可見，水楊酸處理后的棉葉，體內PAL活性在 0～4 d 內迅速增大，4～6 d驟降，6～8 d PAL活性又大幅回升;處理后4 d，隨著水楊酸處理濃度的升高，棉葉PAL活性不斷增大，且均顯著高于CK（P<0.05），其中，5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉PAL活性最大，是CK的2倍;水楊酸處理后6～8 d，0.5 mmol/L 處理的棉葉PAL活性迅速升高，8 d 時PAL活性最大，與其他處理均有顯著性差異，較CK增加40.65%。經單因素多重比較分析可得，棉葉PAL活性的時序變化差異顯著（P<005），各處理濃度間棉葉PAL活性差異顯著，均高于CK。

2.3 水楊酸對棉葉PPO活性的誘導效應

由圖3可見，不同濃度水楊酸處理的棉葉，體內PPO活性在0～4 d迅速升高，4～6 d活性驟降，而后稍有回升;處理后2 d，除0.05 mmol/L 水楊酸處理外，其他濃度處理均顯著高于CK，其中5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉PPO活性最大，是CK的1.63倍;處理后4 d，各處理棉葉PPO活性均顯著高于CK，0.5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉，其PPO活性顯著高于其他濃度，0.05 mmol/L與5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉PPO活性無顯著差異（P>0.05）;處理后6 d，棉葉體內PPO活性均明顯低于CK;處理后8 d，0.5 mmol/L和5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉體內PPO活性均顯著高于CK。經單因素多重比較可得，水楊酸處理后2～4 d，棉葉PPO活性無顯著性差異（P=0.087），處理后0 d和6 d，棉葉內PPO活性也無明顯差異（P=0.163）;0.05 mmol/L 水楊酸與CK處理對棉花PPO活性的誘導作用無明顯差異（P=0.838）。5 mmol/L 水楊酸處理后2 d和0.5 mmol/L 水楊酸處理后4 d對棉葉PPO活性的誘導效果最為明顯。

2.4 水楊酸對棉葉TI的誘導效應

由圖4可見，不同濃度水楊酸處理后，棉葉中TI活性在 0～2 d 緩慢增加，均顯著高于CK，但各濃度間對棉葉TI的誘導效果無明顯差異;處理后4 d，各濃度處理對棉葉體內TI活性的誘導效應最為明顯，其中，5 mmol/L 水楊酸處理對棉葉TI活性的誘導效果優于CK和其他濃度處理，但0.05 mmol/L和 0.5 mmol/L 水楊酸處理間無明顯差異（P>0.05）;處理后4～6 d，水楊酸對棉葉TI活性的誘導效應降低，除 0.05 mmol/L 外，其他濃度處理的棉葉TI濃度均顯著高于CK;處理后8 d，水楊酸對棉葉TI活性的誘導效應有所回升，0.05、0.5 mmol/L 水楊酸處理對TI活性的誘導效果最為明顯，5 mmol/L 水楊酸處理的棉葉體內TI活性與CK無顯著差異。經單因素多重比較分析可得，處理后不同時間對棉葉體內TI活性的誘導效應差異顯著，處理后4 d對TI的誘導效應最為明顯;不同濃度的水楊酸處理，對棉葉TI活性的誘導效應明顯高于CK，5、0.5 mmol/L 水楊酸處理對棉葉TI活性的誘導效果最為明顯，且兩者無顯著差異（P=0.405）。

3 結論與討論

Thulke等報道認為，水楊酸能激活植物局部幾種防御反應，誘導植物體內苯酚類有毒物質的積累，而且還會誘導植物體內POD和甘露醇脫氫酶基因的表達[10]。周瑩等研究結果表明，水楊酸在抵御生物脅迫過程中，會激發植物體內細胞壁的交聯和木質化，PPO、PAL、POD等酶活性的表達[11]。另有研究表明，外源水楊酸會明顯提高擬南芥葉片POD和PAL活性，同時也能誘導番茄幼苗葉片中PPO活性的升高[12-13]。本試驗結果表明，棉花經水楊酸處理后，在一定作用時間和濃度范圍內，會明顯誘導棉葉中總酚含量、PAL活性、PPO活性和TI活性的增加，這與前人研究結論[10-13]吻合。

隨著水楊酸處理時間的延長，棉葉中總酚含量、防御酶活性（PAL、PPO）和TI活性具有先升高后降低隨后又有所回升的特點;高濃度水楊酸處理對棉葉防御功能的誘導效果優于低濃度，總體表現為5 mmol/L水楊酸處理的棉葉，4 d后對棉葉次生代謝、防御酶活性和蛋白酶抑制劑活性的誘導效果最好，這與張永軍等的研究結果[14]類似，這可能與植物在防御過程中的“閾值”有關?？梢?，外源水楊酸適宜的濃度和處理時間，能明顯提高棉葉防御物質的含量和防御酶活性。

參考文獻：

[1]龍亞芹，王萬東，王美存，等. 水楊酸（SA）誘導植物對病蟲害產生抗性及作用機制研究[J]. 熱帶農業科學，2009，29（12）：46-50.

[2]苗 進，李國平，韓寶瑜. 水楊酸和水楊酸甲酯在植物抗蟲中的作用及機制研究進展[J]. 熱帶作物學報，2007，28（1）：111-114.

[3]趙 玲，胡增輝，趙風君，等. 水楊酸甲酯誘抗黑楊對楊扇舟蛾生長發育的影響[J]. 北京林業大學學報，2005，27（1）：75-78.

[4]Hountondji F C，Hanna R，Sabelis M W. Does methyl salicylate，a component of herbivore-induced plant odour，promote sporulation of the mite-pathogenic fungus neozygites tanajoae？ [J]. Experimental &Applied Acarology，2006，39（1）：63-74.

[5]楊 帆. 水楊酸、茉莉酸甲酯誘導黃瓜對西花薊馬（纓翅目：薊馬科）的抗性[D]. 武漢：華中農業大學，2009.

[6]王華磊，馮建榮，樊新民，等. 新疆17個杏品種的抗氧化指標與總酚含量的測定[J]. 果樹學報，2008，25（6）：828-831.

[7]章金明. MeSA、葉蟬為害和機械刺傷對茶芽揮發物及PAL、PPO酶活性影響[D]. 北京：中國農業科學院，2006.

[8]張曉玉，張溫典，田 蘭，等. 不同毒性玉米大斑病菌侵染對感病玉米葉片PAL活性的影響[J]. 玉米科學，2014，22（1）：154-158.

[9]張 健，嚴善春，王 琪. 落葉松結實量對其防御酶和蛋白酶抑制劑活力的影響[J]. 林業科學，2009，45（8）：96-100.

[10]Thulke O，Conrath U. Salicylic acid has a dual role in the activation of defence-related genes in parsley[J]. The Journal of Plant，1998，14（1）：35-42.

[11]周 瑩，壽森炎，賈承國，等. 水楊酸信號轉導及其在植物抵御生物脅迫中的作用[J]. 自然科學進展，2007，17（3）：305-312.

[12]王 媛，楊紅玉，程在全.水楊酸誘導擬南芥對灰霉病的抗性與木質素含量的關系[J]. 植物保護，2007，33（4）：50-54.

[13]胡彥江，張茹琴，王瑞榮，等. 水楊酸、乙酰水楊酸對番茄幼苗葉片中PPO和POD的誘導作用[J]. 西北植物學報，2007，27（2）：262-266.

[14]張永軍，郭予元，吳孔明，等. 化學調節劑誘導轉Bt基因棉花殺蟲蛋白和主要抗蟲次生物的變化[J]. 棉花學報，2002，14（3）：131-133.endprint