多蒴曲尾蘚提取液的抑真菌活性

劉俊華+李玉璽+馬海玲

摘要：采用菌絲生長速率法和孢子萌發2種方法，分析比較了藥用植物多蒴曲尾蘚配子體提取液對植物病原真菌大莖點霉的抑菌活性。結果表明：在質量濃度為120 g/L時，無菌水和80%乙醇2種溶劑蘚體提取液對大莖點霉菌絲生長的抑菌率均達60%以上，其中乙醇提取液的抑菌作用較強，抑菌率為67.47%，EC50 值為27.28 g/L;乙醇提取液對大莖點霉菌孢子萌發的抑菌活性高于對其菌絲生長的抑菌活性，EC50值為19.62 g/L，抑制作用優于水提液。多蒴曲尾蘚對大莖點霉具有良好的抑菌效果，在冬棗輪紋病生物防治方面具有一定的開發潛力和應用價值。

關鍵詞：多蒴曲尾蘚提取物;抑菌活性;大莖點霉;抑菌中濃度

中圖分類號： S482.2+92 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0141-02

收稿日期：2014-05-11

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃 （編號：201210449111）;濱州學院自然科學基金（編號：BZXYLG200701）。

作者簡介：劉俊華（1980—），男，山東高唐人，碩士，講師，主要從事植物生態學教學與研究。Tel：（0543）3191727;E-mail：liujh1980@126.com。

植物病原真菌對農作物的危害較嚴重，尋求環境兼容性好、安全、低毒、經濟的植物源農藥控制真菌引起的農作物病害已成為一種趨勢[1]。我國擁有十分豐富的植物資源，且相當多的物種具有藥用價值。多蒴曲尾蘚（Dicranum majus Turn.）為曲尾蘚科（Dicranaceae）曲尾蘚屬（Dicranum Hedw.）植物[2]，是廣泛分布于我國的一種常見藥用蘚類，其體內富含多種氨基酸[3]。據中醫古籍記載，該蘚全草入藥，氣微，味淡，有清肺止咳功效，多用于治療肺熱咳嗽[3]，在我國民間多有使用，但有關其抑菌活性方面的研究尚未有文獻報道。

本研究以山東省內山區采集的多蒴曲尾蘚配子體為試材，以冬棗輪紋病致病菌大莖點霉菌[4]為受試菌株，利用其配子體水提液、醇提液進行抑制菌絲生長和孢子萌發研究，旨在初步闡明多蒴曲尾蘚抑制真菌活性，為開發以多蒴曲尾蘚為植物源的殺菌劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用多蒴曲尾蘚配子體，采自山東省境內鶴伴山區林下陰濕巖面。野外采集帶回室內，用清水洗凈后自然風干，研磨成粉，冷藏備用。供試菌株為大莖點霉菌（Macrophoma kuwatsukaii），系冬棗輪紋病的病原菌，由濱州學院生物學實驗教學中心提供。

1.2 方法

1.2.1 提取液的制備 準確稱取多蒴曲尾蘚配子體干粉12 g 放入250 mL錐形瓶中，加入80%乙醇作為提取溶劑，置于50 ℃恒溫水浴鍋內浸提24 h。以4 000 r/min 離心 15 min，收集上清液即為浸提液，定容至100 mL，得濃度為120 g/L的提取母液。然后依次稀釋得到濃度為60、30、15、7.5、3.75 g/L的多蒴曲尾蘚提取液;同樣方法制備得到多蒴曲尾蘚配子體水提液，均于4 ℃冰箱內保存備用。

1.2.2 含藥培養基的制備 將上述配制好的提取液分別加入到盛有30 mL PDA培養基的培養皿（直徑90 mm）中制成含藥（蘚體提取液）培養基;同時，以加入相同體積無菌水、80%乙醇PDA培養基作為對照。

1.2.3 菌絲生長速率法測定提取液抑菌活性 按菌絲生長速率法計算抑菌率。待菌絲即將長滿整個培養皿時，在菌絲生長旺盛處用打孔器打取直徑為6 mm的菌餅，接種于帶藥液培養基中心位置，每皿接1個菌餅，每個濃度接種3皿（即每處理3個重復）;置于37 ℃的恒溫培養箱中培養。48 h 后，觀察大莖點霉菌的生長情況，用游標卡尺以“十”字交叉法測量菌落直徑（精確至0.1 mm）。抑菌率計算公式如下：

抑菌率=[（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-6 mm）]×100%。

1.2.4 稀釋平板計數法測定提取物對大莖點霉菌孢子萌發的抑制率 吸取前期活化并制備好的菌懸液，分別加入到上述不同質量濃度的培養基中，用涂菌棒涂布均勻后靜置20 min，再將培養基平板倒置，于37 ℃生化培養箱培養24 h;準確記測菌落數。對照組（分別以無菌水培養和80%乙醇培養）菌落數記為C0，涂布提取物平板菌落數記為C，按下式計算孢子萌發抑制率：抑制率=[（對照萌發率-處理萌發率）/（對照萌發率）]×100%=[（C0-C）/C0]×100%。

1.3 數據的處理與分析

采用Excel 2003及SPSS 18.0 進行數據整理與統計分析，采用Duncans 新復極差法進行組間差異顯著性檢驗;運用提取物對大莖點霉菌菌絲生長及孢子萌發影響的回歸方程，計算相應EC50值。

2 結果與分析

2.1 多蒴曲尾蘚提取物對大莖點霉菌菌絲生長的抑制作用

由表1可知，多蒴曲尾蘚水提液和醇提液對大莖點霉菌菌絲生長均具有一定的抑制作用，在質量濃度為3.75 g/L時，菌絲生長抑制率分別為10.45%和13.85%，抑菌活性隨提取液濃度提高而增強，質量濃度至120 g/L時，2種提取液抑制率均達到60%以上，分別為62.92%和67.47%。同時，從菌絲生長情況來看，處理組與對照組相比，菌落直徑明顯減小，菌絲稀疏、纖細，且易老化。

表1 多蒴曲尾蘚提取物對大莖點霉菌菌絲生長的抑制作用

質量濃度

（g/L）

菌環直徑（mm） 平均抑制率（%）

水提液 醇提液 水提液 醇提液

120 26.2±3.37a 29.9±4.10a 62.92±5.08a 67.47±4.17aendprint

60 29.6±3.60a 32.8±5.00a 59.33±6.19a 63.29±4.47a

30 36.9±2.90a 36.7±4.55b 54.58±5.64a 54.20±3.60b

15 43.4±3.97b 46.1±3.56c 42.90±4.41b 46.13±4.93c

7.5 54.8±3.76c 57.5±4.29d 28.82±5.31c 32.04±4.66d

3.75 69.5±3.48d 72.3±5.10e 10.45±6.32d 13.85±4.32e

0（CK） 80.6±2.74e 80.7±3.06f 0e 0f

注：表中數據為平均值±標準差，同列數據小寫字母表示不同質量濃度處理間差異顯著（P<0.05）。表2同。

由圖1可知，提取液質量濃度與抑菌率間呈正相關關系，其中水提液抑菌力回歸方程為y=15.069lnx-2.864 3（r2=0.922 7，P=0.077），醇提液抑菌力回歸方程為y=15248lnx-0.413 7（r2=0.951，P=0.057）;進一步計算得到2種提取液對大莖點霉菌菌絲生長的EC50值，分別為27.61 g/L（水提液）、27.28 g/L（醇提液）。

2.2 多蒴曲尾蘚提取物對大莖點霉菌孢子萌發的抑制作用

植物病原菌在萌發階段對外來藥劑較為敏感，且其孢子萌發率隨藥液濃度增大呈明顯下降趨勢。由表2可知，多蒴曲尾蘚對大莖點霉菌孢子萌發具有較強的抑制作用，且隨著提取液質量濃度的增高，抑制作用顯著增強。

表2 多蒴曲尾蘚提取液對大莖點霉菌孢子萌發的抑制作用

質量濃度

（g/L）

菌落數（個） 平均抑制率（%）

水提液 醇提液 水提液 醇提液

120 4.7±2.08a 2.7±1.53a 83.53±2.08a 89.61±1.53a

60 7.7±2.52ab 6.3±1.53b 72.94±2.52ab 75.32±1.53b

30 11.7±2.08b 10.7±2.08c 58.82±2.08b 58.44±2.08c

15 16.3±2.52c 14.0±2.00c 42.35±2.52c 45.45±2.0c

7.5 21.0±2.65d 18.3±1.53d 25.88±2.65d 28.57±1.53d

3.75 25.3±2.08e 22.3±2.52e 10.59±2.08de 12.99±2.52e

0（CK） 28.3±3.51e 25.7±2.52e 0e 0e

由圖2可知，醇提液對大莖點霉菌孢子萌發的抑制作用略強于水提液。通過對提取液質量濃度與孢子萌發抑制率間進行回歸分析，得到水提液和醇提液與孢子萌發抑制率間的回歸方程，分別為：y=22.108lnx-15.801（r2=0.995 4，P=0.022）、y=21.531lnx-16.751（r2=0.999 1，P=0014），依方程計算得2種提取液抑制大莖點霉菌孢子萌發的EC50值，分別為22.20 g/L、19.62 g/L。

3 結論與討論

本研究結果表明：多蒴曲尾蘚提取液對冬棗輪紋病致病菌大莖點霉的生長具有較強的抑制作用，在供試質量濃度120 g/L時，多蒴曲尾蘚提取液對大莖點霉菌的抑制率均在60%以上，對孢子萌發的抑制率達80%以上，其抑菌活性隨質量濃度的增大而增強，且在中高濃度下（30～120 g/L）2種提取液大莖點霉菌孢子萌發的抑制率高于對其菌絲生長的抑制率。無論對大莖點霉菌菌絲生長還是孢子萌發，相對于無菌水提取液，乙醇提取液均表現出更強的抑制作用（表1、表2）。

苔蘚植物能夠產生如萜類、黃酮類、脂肪酸等次生代謝產物及一些生物活性物質，是潛在的天然活性產物寶庫[5-9]。目前，已有多種苔蘚植物被證明有抑制微生物活性的作用[5-6，8-10]，從苔蘚植物中篩選抗菌、防腐、抗癌、防治心血管疾病、抗凝血和降血脂等藥物將具有廣闊的前景。

本研究初步闡明了多蒴曲尾蘚對冬棗輪紋病致病菌的抑菌作用，但其抑菌機制尚不明了。同時，由于本試驗只測定了

其粗提液的抑菌活性和EC50，對其抑菌主效成分尚不清楚，仍需圍繞上述問題開展深入研究，為開發能有效應用于冬棗輪紋病生物防治的植物源殺菌劑提供理論基礎與技術支持。

參考文獻：

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