茅山地區蟬花菌株的分離及其多糖生物活性的研究

陳成+許佳偉+孫細涓+賈俊強+桂仲爭

摘要：對采自江蘇句容茅山地區的蟬花進行組織分離，獲得1株組織分離菌株，運用rNDA ITS區段對分離菌株進行分子生物學鑒定。結果表明，該菌株為蟲草屬類的被孢霉屬菌株，命名為JR_cds1。蟬花中蟲草素含量顯著高于蠶蛹蟲草和冬蟲夏草。通過水提醇沉以及Sevage法除蛋白等方法提取蟬花多糖，研究其生物學活性及抑菌作用，結果顯示，該蟬花多糖具有較高的清除DPPH自由基活性，高的Fe2+ 螯合能力，抑制血管緊張素轉化酶（ACE）的活性;對大腸桿菌（G-）和枯草芽孢桿菌（G+）以及鏈格孢屬真菌顯示較好的抑菌效果。

關鍵詞：蟬花;菌株分離;分子鑒定;多糖;抗氧化;抑菌作用

中圖分類號： Q936 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0347-05

收稿日期：2015-01-27

基金項目：國家公益性行業（農業）科研專項（編號：201403064）。

作者簡介：陳 成（1991—），女，碩士研究生，主要從事微生物資源利用研究。Tel：（0511）85616716;E-mail：317657686@qq.com。

通信作者：桂仲爭，研究員，博士生導師，主要從事生物資源功能性利用研究。Tel：（0511）85616716;E-mail：srizzgui@hotmail.com。

蟬花（Ophiocordyceps sobolifera）又稱蟬菌蟬蛹草，是麥角菌科真菌蟬擬青霉寄生竹蟬若蟲后的復合體，與冬蟲夏草相類似的蟲草[1]，為名貴中藥材。蟬花是從單個或是2～3個蟬幼蟲頭部生長出來，約3.4 cm長，從頂端開花分枝（如圖1）。秋季來臨，蟬鉆入土中，逐漸變成蟬蛹，在羽化前被蟲草類真菌寄生，在適宜的環境下開始萌發成菌絲體，吸收蟲體的營養，菌絲體從營養階段轉化為有性階段，漸漸從頂端開花分枝，故而得名蟬花。蟬花主要分布在我國的四川、江蘇、浙江、福建以及安徽、云南東部。

早在宋代唐慎微的《征類本草》，明朝李時珍的《本草綱目》以及之后的藥典都有蟬花功效的記載，蟬花的歷史記載比冬蟲夏草早800年，被稱為最古老的蟲草。蟬花與冬蟲夏草同屬于蟲草類中藥材，主要包含的有效成分有：蟲草素、腺苷、蟲草多糖、蟲草酸等;蟬花含有16種氨基酸，其中人體必需氨基酸7種，蟲體與菌座游離氨基酸總量及水解氨基酸含量略低于冬蟲夏草[2]?！侗静菥V目》記載，該菌功同蟬蛻，可止瘧疾;《類證本草》中也提到蟬花能夠主治小兒驚癲、夜啼、心悸等[3]。國內外研究表明，蟬花具有提高免疫力、抗疲勞、保腎、改善、睡眠、抗腫瘤、保肝、抗輻射和明目等多重作用。因此，蟬花可以作為冬蟲夏草的代用品，達到滋補養生的作用。但天然的蟬花非常稀少，野生金蟬花更稀奇珍貴，這限制了蟬花大量使用。不同地區不同生態環境采集的蟬花分離物，極具物種多樣性，它們在遺傳和形態上具有明顯的差異，故蟬花菌株的分離與鑒定是蟬花研究的關鍵環節。

多糖是由許多單糖聚合而成的天然高分子化合物，是生命有機體的重要組成部分。已發現許多真菌多糖具有清除自由基、提高抗氧化酶活性和抑制脂質過氧化的活性起到保護生物膜和延緩衰老的作用[4]。本研究對從江蘇省句容市茅山鎮竹林山區采取的蟬花菌株進行分離鑒定，研究蟬花主要活性成分含量、蟬花多糖的抗氧化活性以及對細菌（大腸桿菌、枯草芽孢桿菌）和真菌（鏈格孢屬）的抑菌效果。以明確該蟬花菌株的基本生物學特性及其多糖的生物學活性，為進一步開發蟬花提供依據。

1 材料與方法

1.1 蟬花及試驗菌種

野生蟬花采自江蘇省句容市茅山鎮竹林山區，海拔約 150 m。試驗用大腸桿菌（Escherichia coli）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由筆者所在實驗室保存;鏈格孢屬（Alternaria sp.）由筆者所在實驗室從桑椹中分離并保存。

1.2 試劑

腺苷標準品和鼠李糖等為上?；瘜W試劑公司進口分裝，蟲草素標準品購自常州大康保健藥品有限公司。

Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒、酵母膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氯仿、正丁醇、濃硫酸、苯酚、1，1-二硝基-2-三硝基苯肼（DPPH）、維生素C、菲洛嗪、鐵氰化鉀、氯化亞鐵、EDTA均購自Bio Basic有限公司。其他試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器與設備

L-7420型高效液相色譜儀（日本東芝高技術公司）、RF-20A超高靈敏度熒光檢測器（島津國際貿易上海有限公司）、SY-601型超級恒溫水?。ㄌ旖蚴袣W諾儀器儀表有限公司）、AL104-IC型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）、H205DR-1型高速冷凍離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）、WFZ-UV-2100型紫外可見分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）、無菌超凈臺（上海新苗醫療器械制造有限公司）、5424型臺式高速離心機（德國Eppenderf公司）、JD-801M型凝膠電泳圖像分析系統（江蘇捷達科技發展有限公司）、MG 96G型PCR儀（杭州朗基科學儀器有限公司）、GNP9270型隔水式恒溫培養箱（上海精密實驗設備有限公司）、LRH-250-Z型振蕩培養箱（韶關市泰宏醫療器械有限公司）、DHG-9143BS型電熱鼓風干燥器（上海新苗醫療器械制造有限公司）

1.4 蟬花菌株的分離與鑒定

1.4.1 組織分離 將新鮮蟬花分為菌膜、子座、菌核三部分進行菌種分離。用滅菌后的解剖刀除去表皮，各部位切成（2～3） mm×（2～3） mm的組織塊，用0.1%的HgCl2溶液浸泡3～4 min，75%乙醇浸泡1 min進行表面消毒，無菌水漂洗，無菌濾紙吸干。置于含氨芐青霉素的PDA平板上，25 ℃倒置培養。待組織塊周邊長出菌絲后，挑菌落邊緣菌絲，移至新的培養基，純化菌株，獲得蟬花菌株，保存備用。endprint

1.4.2 菌株的形態觀察 將分離的菌株分別接種到沙氏、查氏和PDA培養基上，25 ℃培養3～4 d，觀察菌落顏色、大小、形狀及邊緣形狀。在顯微鏡下觀察菌絲有無隔，分生孢子梗，分生孢子大小、形狀等。

1.4.3 菌株的分子鑒定 采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒，對在PDA液體培養基上培養4 d的菌絲球抽提基因組DNA，采用真菌ITS區擴增通用引物。（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG，ITS2：TCCTCCGCTTATTGATATGC）對核糖體轉錄間隔區ITS進行PCR擴增，擴增條件為：94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環;72 ℃延伸10 min。瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR擴增產物，DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，連接到 pMD-18T 載體，再轉化到大腸桿菌Top10細胞中，篩選陽性克隆，送上海生工生物工程股份有限公司測序。獲得的ITS序列進行Blast比對，利用軟件ClusterX進行多重序列比對，軟件Mega中Neighbour-Joining方法（鄰接法，NJ）構建系統發育樹，對分離菌株與Genebank 數據庫中登錄的近源菌株系統發育關系進行分析。結合形態學特征，確定菌株的分類地位。

1.5 蟬花主要活性成分的測定

蟲草素和腺苷的提取與測定：依據《中國藥典》2005版，采用高效液相色譜法[5-6]。

蟲草酸的提取與測定：采用分光光度計法[6-7]。

1.5 蟬花多糖的制備與含量測定

1.5.1 蟬花多糖的制備 （1）多糖提?。悍Q取100 g蟬花干粉，加2 000 mL水于80 ℃水浴浸提10 h，布氏漏斗抽濾得濾液，連續浸提2次，合并濾液。濾液用旋轉蒸發儀于80 ℃濃縮至一定體積。（2）醇沉：加入無水乙醇至終濃度為90%，置于4 ℃過夜，離心得沉淀，將沉淀復溶于一定蒸餾水中。（3）除蛋白、去離子：用Sevag法除去多糖溶液中的蛋白質。再用自來水和蒸餾水分別透析48 h除去小分子物質和部分色素。

1.5.2 蟬花多糖的含量測定 采用苯酚-硫酸法[8]測定蟬花多糖的含量。以葡萄糖為標準對照，于490 nm處測定吸光度，根據葡萄糖含量與吸光度回歸方程計算多糖含量。

1.6 蟬花多糖抗氧化活性

1.6.1 清除DPPH自由基能力 參照Luo等的方法[8]并略有調整。稱取一定量的1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），用無水乙醇配成0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別取 2 mL 不同濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的蟬花多糖提取液，加入DPPH溶液2 mL，混合均勻，室溫放置30 min后，5 000 r/min離心10 min。取上清液于517 nm處測吸光度。用維生素C作陽性對照。樣品中自由基清除率用下面公式計算：

清除率=[1-（D1-D2）/D0]×100%。

式中：D0為2 mL無水乙醇+2 mL DPPH溶液的吸光度;D1為2 mL樣品溶液+2 mL DPPH溶液的吸光度;D2為2 mL樣品溶液+2 mL無水乙醇的吸光度。

1.6.2 總還原能力 采用Tsais等的方法[9]測定。在10 mL離心管中分別加入用0.2 mol/L pH值6.6的磷酸緩沖液配制的不同濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的蟬花多糖提取液，加入1%鐵氰化鉀2 mL，混合均勻后于50 ℃反應20 min。取出后加入10%三氯乙酸2 mL終止反應，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL FeCl3，混勻后靜置10 min，在700 nm處測吸光度。維生素C作陽性對照。

1.6.3 對Fe2+鐵離子螯合能力 參考Decker等的方法[10]并略有調整。分別取3 mL不同濃度（2、4、6、8、10 mg/mL）的蟬花多糖提取液，加入2 mmol/L的FeCl2溶液0.05 mL和 5 mmol/L 的菲洛嗪溶液，劇烈振蕩后室溫放置10 min，于 562 nm 處測吸光度。EDTA為陽性對照。樣品對Fe2+的螯合率計算公式如下：

螯合率=[D0-（D1-D2）]/D0×100%。

式中：D0為3 mL蒸餾水代替反應體系中樣品溶液后的吸光度;D1為樣品溶液反應后的吸光度;D2為0.05 mL的蒸餾水代替反應體系中FeCl2溶液后的吸光度。

1.6.4 對血管緊張素轉化酶（ACE）抑制率 將10 μL ACE酶液與10 μL不同濃度（6、12、18、24、30 mg/mL）蟬花多糖提取液混合均勻，對照組加入10 μL蒸餾水代替蟬花多糖提取液，37 ℃水浴5 min，然后加入濃度為6.5 mmol/L 的HHL（馬尿酰-組氨酰-亮氨酸）反應底物（用pH值8.3的硼酸鹽緩沖液配制），37 ℃水浴反應30 min，之后加入85 μL 1 mol/L的HCL終止反應，再向反應混合液中加入1 mL乙酸乙酯，搖勻數分鐘后，4 000 r/min離心10 min，吸取上清液800 μL，放入干燥箱里90 ℃烘干后，加入等量的蒸餾水溶解，檢測D228 nm值?？瞻讓φ赵诩尤際HL底物之前加入85 μL濃度為1 mol/L的HCl，使ACE失活，以后的操作步驟與蟬花多糖提取液的處理一致[11]。

ACE抑制率=[C-（S-B）]/C×100%。

式中：C為未加蟬花多糖提取液對照組的吸光度;B為空白對照組的吸光度;S為添加蟬花多糖提取液試驗組的吸光度。

1.7 蟬花多糖的抑菌試驗

1.7.1 蟬花多糖對細菌的抑菌作用 在超凈工作臺中，將滅菌后的培養基趁熱倒入培養皿中，待其凝固后，用移液槍吸取 0.1 mL大腸桿菌或枯草芽孢桿菌懸液于平板上，用涂布器涂布均勻。用打孔器在上述平板中心的四角對稱位置，打上大小一致、直徑為6 mm的4個小孔，分別加入大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、抗生素（陽性對照）和無菌水（陰性對照）。將上述平板于25 ℃培養箱中黑暗培養3～4 d，取出觀察抑菌效果。endprint

1.7.2 蟬花多糖對真菌的抑菌作用 在超凈臺中，用無菌打孔器在培養基平板中心及其四角對稱位置，打上4個直徑為6 mm的小孔。平板中心放入鏈格孢屬菌塊，其余4孔分別設為加入0.1 mL無菌水的空白對照、0.1 mL蟬花多糖的試驗組2組和0.1 mL抗真菌藥咪康唑的陽性對照。將上述平板于25 ℃培養箱中黑暗培養3～4 d，取出觀察抑菌效果。

2 結果與分析

2.1 蟬花菌株的分離

將經蟬花組織塊接種到PDA培養基上，經多次分離純化培養得到單菌落，并在顯微鏡下觀察菌落特點。蟬花分離初期菌落在PDA培養基上，菌落致密，淺黃色，菌落白色其上布滿白色孢子粉（圖2-A）。分生孢子顯微鏡下觀察呈短柱形（圖2-B）。

2.2 蟬花菌株ITS區段基因分子鑒定

本試驗中采用ITS1、ITS2引物對蟬花基因組DNA進行ITS區段擴增，PCR擴增結果如圖2。PCR擴增出的條帶十分明亮，條帶大小在500～750 bp之間，符合ITS1-5.8S-ITS2理論大小，將膠切割，回收，連接載體，轉化后搖菌挑斑，送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結果在NCBI上比對，下載相鄰種屬ITS序列。

經Clustal X1.83軟件對測序結果和從GenBank中搜索到的相似序列進行對位排列，并輔以人工校對，系統發育分析采用MEGA4中的鄰近相鄰法（neighbor-joining;NJ）構建、分析，各分支的置信度經bootstrap 1 000次循環檢驗各分支的系統學意義與可靠性。結合GenBank上的9個蟲草有關序列進行了系統發育樹構建。分枝統計支持率評估采用Bootstrap法，自展值為1 000。由圖4可知，所有序列形成2個大的分支，分離的蟬花菌種與被孢霉屬（Mortierella sp.）以及擬青霉屬（Paecilomyces）、蟬花（Cordyceps sobolifera）構成了一個大的分支。與蟲草屬（Cordyceps）相似度達到95%，暫命名為 JR_cds1。

2.3 蟬花主要活性成分

蟲草素、腺苷、蟲草酸和多糖等含量是評價蟲草類的主要質量指標。表1為蟬花JR_cds1主要成分含量，其中蟲草素含量達3.437 mg/g，在所有蟲草類產品中最高。

表1 蟬花菌株JR_cds1主要成分含量

成分 含量（mg/g）

蟲草素 3.437

腺苷 1.251

蟲草酸 57.75

多糖 9.514

2.4 蟬花多糖抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除率 DPPH自由基是一種人工合成的穩定自由基，被廣泛用于評價抗氧化物質清除自由基的活性。維生素C是一種抗氧化活性高的還原劑，維生素C常作為抗氧化活性的陽性對照。由圖5中可以看出，隨著多糖濃度增加，對DPPH自由基清除率也越大。當多糖濃度為10 mg/mL時其清除率達到88.1 %，接近維生素C的清除率。表明蟬花多糖有良好的清除自由基作用。

2.4.2 蟬花多糖總還原能力 一般來說，物質還原能力越強，其抗氧化活性也越高。以維生素C作為陽性對照，蟬花JR_cds1多糖的總還原能力隨著多糖濃度的增加而提高，總還原能力與多糖濃度呈正相關關系。

2.4.3 蟬花多糖對Fe2+的螯合能力 一些過渡金屬離子如Fe2+等極容易通過Fenton反應產生羥自由基，觸發一系列脂質過氧化反應，而螯合劑則通過螯合這些過渡金屬離子來抑制氧化反應。因此， 對金屬離子螯合能力的測定是評價其抗

氧化活性的一項重要指標[12]。EDTA是常用的螯合劑，常作為陽性對照。由圖7可知，當多糖濃度為2～4 mg/mL時隨著多糖濃度的增加，亞鐵離子螯合率隨之快速提高;隨著多糖濃度的提高其螯合率增加幅度趨緩;當多糖濃度為 10 mg/mL 時，其螯合率達到54.2 %。

2.4.4 蟬花多糖對ACE的抑制率 血管緊張素轉換酶（ACE）可水解血管緊張素Ⅰ羧基端二肽，產生使血壓上升的物質——血管緊張素Ⅱ，還可以切除降血壓活性物質緩激肽的羧基端二肽，使之失活，因此通過抑制ACE活性即可實現降低血壓之目的。目前已有大量抑制ACE活性的天然產物被發現，如食源性的黃酮類蕓香苷和黃連素等[13]。本試驗研究了蟬花多糖對ACE活性的抑制作用，圖8顯示，蟬花多糖對ACE活性有較好的抑制作用。隨著多糖濃度的增加，其抑制效果逐漸提高，當多糖濃度為30 mg/mL時，其抑制率超過80%。

2.5 蟬花多糖的抑菌試驗

2.5.1 蟬花多糖的抑菌作用 試驗比較了革蘭氏陰性菌大腸桿菌（G-）和革蘭氏陽性菌枯草芽孢桿菌（G+）與蟬花多糖共培養時的生長效果。由圖9-A可以看出，蟬花多糖對大腸桿菌有抑制作用，圖中孔1、孔2（蟬花多糖）周圍有明顯抑菌圈，雖然沒有陽性對照青霉素明顯，但相對無菌水而

言，效果顯著。圖9-B中3為氯霉素，作為抑制枯草芽孢桿菌的陽性對照，孔1、孔2（蟬花多糖）周圍的細菌明顯比陰性對照組（無菌水）稀少，表現出一定的抑菌性。

2.5.2 蟬花多糖對鏈格孢屬交鏈孢霉的抑菌作用 試驗以31.7 mg/mL的多糖濃度與鏈格孢屬交鏈孢霉共培養，圖10為真菌生長培養皿的正面圖和背面圖。中央為接種的交鏈孢霉菌塊，在距其中心點2 cm的上、下、左、右處分別用無菌打孔器打孔。設抗真菌藥物咪康唑為陽性對照（孔4），無菌水為陰性對照（孔3），孔1和孔2為蟬花多糖。圖10 顯示，菌絲向孔3（無菌水對照）方向生長不受限制，呈弧形;而菌絲向孔1、孔2和孔4方向生長受到明顯抑制，形成一個彎弧形，孔4陽性對照與其他試驗組差異顯著，表明蟬花多糖對交鏈孢霉的生長具有顯著的抑制作用。

3 分析與討論endprint

據報道，蟬擬青霉的寄主有7種，即竹蟬（Platylomia pieli）、山蟬（Cicada flammata）、蟪蛄（Platyleura kaempferi）、云南黑蟬（Cicadatra shaluensis）、草蟬（Mogannia conica）、小鳴蟬（Oncotympana ella）和透翅蟬（Hyalessa ronsnana），多分布在中國南方諸省。竹蟬常見于毛竹產區， 是蟬擬青霉的重要寄

主。此蟲6年1代，每代5齡，常年生活在土壤中，以老齡若蟲最易感病。在氣溫18～24 ℃，相對濕度大于80%的溫暖濕潤季節，在淺土層活動的老齡若蟲接觸帶菌的土壤發生感染。到翌年6、7月份，溫濕度合適，發病死亡蟲體前端長出淺黃色或蛋黃色孢梗束，突破表土，伸向地面，形成蟬花[14]。在江蘇句容茅山地區生長著竹林的丘陵地帶（海拔80～200 m），地勢平緩，土質疏松，濕度較大，地面覆蓋有枯枝落葉層，是竹蟬活動的主要林地。

真菌基因組DNA包含著一些非編碼基因，如信號序列、間隔序列，無功能序列。這些基因在結構、功能和變異程度上差異很大，是真菌在分子水平上研究的良好區段[15]。其中rDNA ITS序列由于片段小、易于擴增，在真菌形態不同的種間甚至同種的分離菌株間存在高度的差異，因此常用于屬內種間或種內群體的比較分析[16]。有報道基于ITS序列的分析比較，從不同地理來源的蟬花上分離出C.cicadae 和 L. fungicola，說明寄生于蟬若蟲并形成蟬花的真菌有2種甚至多種，與蛹蟲草及其無性型同輪枝菌屬具有密切的關系[17]。本試驗中分離的菌株為被孢霉屬（Mortierella），與蟲草屬（Cordyceps）構成了2個相近的分支?？梢酝茰y：寄生真菌表型特征的趨同現象、基因水平上的多樣性是寄生真菌為適應寄主而產生的結果[17]。由此可見，本研究分離得到的1株蟲草屬真菌極可能是蟬花菌種的某一無性型菌株。張傳博等從江蘇省句容市天王鎮磨盤山分離到1株金蟬花，鑒定為大蟬草，也屬蟲草屬，命名為磨盤山金蟬蟲草[18]，該菌株的形態特征與本研究分離的蟲草屬JR_cds1相似，是否為同一菌屬還有待進一步鑒定。

蟬花含有與冬蟲夏草相似或一致的活性物質如蟲草素、腺苷、多糖及蟲草酸等。本研究顯示，蟬花中蟲草素的含量（3.437 mg/g）顯著高于蛹蟲草（2.83 mg/g）和冬蟲夏草（003 mg/g），腺苷含量（1.251 mg/g）接近冬蟲夏草 （0.48 mg/g） 的3倍[6，19]，提示蟬花有較高的營養價值，具有開發利用前景。

多糖為免疫調節劑，具有多種生物學活性。本試驗研究了蟬花多糖的抗氧化和抑制血管緊張素轉換酶（ACE）的活性。結果顯示，蟬花多糖具有較好的清除DPPH自由基能力，一定的總還原能力和對Fe2+ 的螯合能力。其對Fe2+ 的螯合能力與Wu等研究的蛹蟲草多糖結果[20]相近。有報道稱，能清除DPPH自由基的物質與其抑制脂質過氧化能力呈一定的正相關，因此DPPH自由基體系適用于評價天然產物的抗氧化性[21]。王吉標等研究了蟬花多糖水提物，結果顯示，在相同的濃度下，金蟬花正丁醇部位和多糖的總抗氧化性能較強，僅次于維生素C[22]，說明蟬花多糖的確有較好的抗氧化性。但不同的提取方法會影響測得的結果。

翁梁采用比濁法研究了野生蟬花多糖與人工蟬花多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制作用，顯示蟬花多糖對大腸桿菌的抑制作用最為明顯，且抑菌效果與多糖濃度成正比[23]。本試驗蟬花多糖對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有抑菌作用的結果與之吻合。此外，本研究結果還顯示，蟬花多糖對真菌的抑制效果明顯優于對細菌的抑制效果（圖10）。多糖抑制微生物生長的作用機制尚不清楚。有報道認為，杯牛漆多糖對大腸桿菌的抑制作用是通過抑制細胞黏附來實現的[24];而紫萁多糖廣譜抗菌性是因為多糖溶解形成的膠體溶液能在細胞表面或膠體表面形成保護層[25]。蟬花多糖的抑菌作用機制有待深入研究。

參考文獻：

[1]程東慶，丁志山，林美愛，等. 蟬花真菌的分離及液體發酵培養[J]. 中藥材，2006，29（2）：99-101.

[2]官宗華，宋玉良，滕 曄，等. 金蟬花菌種的分離和培養[J]. 內蒙古中醫藥，2012，31（18）：34.

[3]劉愛英，胡海燕，羅 力，等. 蟬花及其分離真菌的形態多樣性（摘要）[C]//2008全國藥用真菌學術研討會論文集.中國菌物學會藥用真菌專業委員會、中國藥學會藥用真菌專業組，2008：45-46.

[4]李小定，榮建華，吳謀成. 真菌多糖生物活性研究進展[J]. 食用菌學報，2002，9（4）：50-58.

[5]郭 澄，朱 杰，張 純，等. 高效液相色譜法測定人工蟲草菌絲中腺苷和蟲草素的含量[J]. 中國中藥雜志，1998，23（4）：44-45，64.

[6]朱雅紅，桂仲爭. 蛹蟲草液體菌種通氣發酵培養及其營養成分分析[J]. 食品與生物技術學報，2009，28（5）：699-704.

[7]葛 新，白小紅，李云蘭.分光光度法測定蛹草D-甘露醇的含量[J]. 山西醫科大學學報，2001，32（4）：317-318.

[8]Luo W Z M，Rao G. Identification of bioactive compounds in Phyllenthus emblica L. fruit and their free radical scavenging activities[J]. Food Chemistry，2009，114（2）：499-504.

[9]Tsais Y，Huang S J，Mau J L. Antioxidant properties of hot water extracts from Agrocybe cylindracea[J]. Food Chemistry，2006，98：670-677.endprint

[10]Decker E A，Welch B. Role of ferritin as a lipid oxidation catalyst in muscle food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1990，38：674-677.

[11]Jia J M H，He R. The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein[J]. Food Chemistry，2010，119（1）：336-342.

[12]Park D S，Kim K T，Park Y J，et al. PCR-based sensitive detection of wood-decaying fungus Phellinus linteus by specific primer from rDNA ITS regions[J]. Formerly the Korean Journal of Mycology，2001，29（1）：7-10.

[13]劉艷偉，任子旭，方 銀，等. 桑枝皮提取物抑制血管緊張素轉換酶活性的提取工藝優化[J]. 蠶業科學，2014，40（3）：499-504.

[14]肖建輝，梁宗琦，劉愛英. 蟲草無性型及其相關真菌多糖的研究開發現狀[J]. 藥學學報，2002，37（7）：589-592.

[15]Sánchez-Ballesteros J G V，Peláez F. Phylogenetic study of Hypoxylon and related genera based on ribosomal ITS sequences[J]. Mycologia，2000，92：964-977.

[16]朱有勇，王云月，Lyon B. 大麗輪枝菌核糖體基因ITS區段的特異擴增[J]. 植物病理學報，1999，29（3）：250-255.

[17]Obornik M，Jirku M，Dolezel D. Phylogeny of mitosporic entomopathogenic fungi：is the genus Paecilomyces polyphyletic？[J]. Canadian Journal of Microbiology，2001，47（9）：813-819.

[18]張傳博，王艷麗，易 萌，等. 江蘇省天王鎮磨盤山金蟬花分離菌株鑒定及系統發育分析[J]. 廣東農業科學，2013，40（15）：152-154，封4.

[19]桂仲爭，滕國琴，賈俊強，等. 蛹蟲草食藥用開發價值[J]. 中國食物與營養，2012，18（3）：70-73.

[20]Wu F Y，Hui Y，Ma X N，et al. Comparison of the structural characterization and biological activity of acidic polysaccharides from Cordyceps militaris cultured with different media[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，28（5）：2029-2038.

[21]Kim S Y K J，Jung M. Y.antioxidant activities of selected oriental herb extracts[J]. Journal of the American Oil Chemists Society，1994，71（6）：633-640.

[22]王吉標，歐陽臻，趙 明，等. 響應面分析法優化金蟬花多糖的提取工藝[J]. 天然產物研究與開發，2014（3）：438-443.

[23]翁 梁. 野生蟬花與人工蟬花多糖的提取及抑菌試驗[J]. 農業科技與裝備，2010（11）：22-24，29.

[24]馬寶瑕，陳 新，鄧軍娥. 中藥多糖研究進展[J]. 中國醫院藥學雜志，2003，23（6）：42-44.

[25]羅婭君，楊葵華. 藥用蕨類植物多糖研究進展[J]. 綿陽師范學院學報，2008，27（11）：71-74.endprint