楊樹EBP1基因的克隆與表達載體構建

李慧+李愛+彭立新+閻國榮

摘要：器官大小是植物形態的重要表現特征之一，也是決定一些作物或經濟植物產量和品質的重要因素。研究證實，草本植物如擬南芥中EBP1類轉錄因子可從細胞數量和體積2個方面同時調控植物器官大小，但該基因在木本植物楊樹中的結構及功能仍未知。本研究依托楊樹全基因組及EST數據信息，采用生物信息學方法結合基因同源序列克隆，首次對楊樹中的EBP1全長cDNA進行克隆及序列分析，同時成功構建了用于遺傳轉化的過表達載體。

關鍵詞：楊樹;EBP1基因;克隆;表達載體;構建;基因序列分析;蛋白同源性比對

中圖分類號： Q943.2 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）04-0014-03

收稿日期：2014-05-25

基金項目：天津市高等學?？萍及l展基金（編號：20120619）;天津市應用基礎與前沿技術研究計劃（編號：14JCQNJC15000）。

作者簡介：李 慧（1981—），女，河北廊坊人，碩士，講師，主要從事植物分子生物學研究。E-mail：lihui@tjau.edu.cn。

通信作者：閻國榮，博士，教授，主要從事植物資源學研究。E-mail：yanguorong@eyou.com。

自然界中植物種類繁多、形態各異，其中器官大小是造成植物形態多樣性的主要因素之一。不同植物間器官大小可能存在顯著差異，但就同一物種內相同基因型的不同植物個體而言，在相同的生長環境下它們的器官大小基本一致，表明植物各器官最終大小的形成受到嚴格的遺傳調控[1]。因此，近年來從不同植物中挖掘參與器官大小發育調控的基因或轉錄因子并揭示其調控機制的研究備受關注，并已在擬南芥和一些農作物如水稻、玉米、油菜、番茄、馬鈴薯等中取得了長足的研究進展[1-2]。有研究發現，在外界生長條件一致的情況下，植物各器官的最終大小在細胞水平上受細胞數量和大小的協同控制[3]。因此，分離、克隆參與調控植物細胞數量和大小的基因并闡釋其功能是揭示植物器官大小發育控制機制的關鍵。目前，在擬南芥等草本植物中已有多個相關基因和轉錄調控因子被成功分離和克隆。有研究表明，AINTEGUMENTA（ANT）[4]、ANGUSTIFOLIA3（AN3）[5]、GROWTH-REGULATING FACTOR5（AtGRF5）[5]、GRF-INTERACTING FACTOR（GIF）[6-7]、JAGGED（JAG）[8]、STRUWWELPETER（SWP）[9]、SWELLMAP1（SMP1）[10]、KLUH（KLU）[11]、EBP1[12]及Auxin-Regulated Gene involved in Organ Size（ARGOS）[13-14]等主要通過正向調控細胞增殖能力控制器官內細胞數量，進而影響器官大小。這些基因的異位過表達可通過延長細胞增殖時間導致植物器官變大，而突變則會導致植株器官整體變小。另外，還有一些基因通過調控細胞大小來影響器官的大小，如ARGOS-LIKE（ARL）[15]、ROTUNDIFOLIA3（ROT3）[16]、AtGRF1/2[17]、BIGPETAL[18]、AtTOR[19]、ORGAN SIZE RELATED1（OSR1）[20]等，其中擬南芥中EBP1被證實對植物細胞數量和大小均能發揮正向調控作用[12]。擬南芥EBP1是和人類的ErbB-3表皮生長因子受體結合蛋白同源的一個基因，與核糖體的生物合成相關，該基因在進化上具有較高的保守性。目前除在擬南芥外，在沙冬青和馬鈴薯中也有該基因序列的相關報道，但該基因在其他植物中的功能仍未知，特別是在木本植物中，尚未有該基因的相關報道。因此，本研究對楊樹中EBP1基因進行克隆，并對其表達載體進行構建。相關研究對進一步揭示楊樹EBP1的功能具有重要意義，同時對采用基因工程等手段提高林木產量和品質具有潛在的應用價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黑楊（Populus nigra），種植于南開大學校園內;pEASY-T1載體，購于北京全式金生物技術有限公司;植物表達載體pBI121、農桿菌LBA4404，均由筆者所在實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 黑楊總RNA提取及反轉錄 采用改良的CTAB法提取黑楊葉片總RNA，以Oligo dT（18）為逆轉錄引物，在 M-MLV 作用下逆轉錄成cDNA。

1.2.2 引物設計及同源克隆 以擬南芥及其他草本植物中已經報道的EBP1基因DNA及cDNA序列為種子序列，利用Blast序列比對軟件搜索楊樹基因組及EST數據庫，獲得楊樹中候選EBP1基因序列。隨后根據篩選、獲得的楊樹中EBP1候選序列設計引物，進行擴增，并對擴增結果進行測序驗證。進一步對NCBI數據庫中收集的楊樹EBP1相關EST序列進行分析，結合測序結果，對楊樹中EBP1基因全長cDNA序列進行克隆及序列分析。

1.2.3 楊樹EBP1表達載體構建及分子鑒定 根據已獲得的楊樹EBP1候選基因全長cDNA序列，設計帶有酶切位點的全長cDNA擴增引物，對EBP1全長cDNA進行擴增及 T-A 克隆。挑取含有楊樹EBP1全長cDNA的陽性克隆，放大培養并提取質粒，通過雙酶切獲得帶有黏性末端的EBP1全長cDNA序列。進而與經過相同雙酶切的植物表達載體pBI121采用T4連接酶進行連接，最終獲得EBP1重組表達載體。將重組載體轉入大腸桿菌感受態細胞，在LB+卡那霉素（Kan）板上篩選陽性克隆進行菌液PCR和酶切驗證，進而獲得插入方向和序列完全正確的陽性克隆。隨后將該陽性克隆放大培養，采用質粒提取試劑提取重組質粒，并采用凍融法將該重組質粒導入農桿菌LBA4404感受態細胞，在YEB+鏈霉素（str）+利福平（Rif）板上篩選陽性克隆進行菌液PCR驗證。

2 結果與分析

2.1 楊樹EBP1基因的克隆

根據序列同源性分析結果，設計引物對EBP1-1F：5′-ATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和 EBP1-1R：5′-TTCCTAGACGGCGGTGG-3′，以黑楊cDNA為模板對楊樹中EBP1候選基因進行克隆。擴增結果顯示，黑楊中EBP1候選基因全長cDNA約為1.2 kb（圖1）。將獲得的cDNA通過T-A克隆方法，連入pEASY-T載體，挑取陽性克隆進行測序。測序結果顯示，楊樹中EBP1基因全長cDNA序列長度為1 215 bp，將其命名為PtEBP1。

2.2 楊樹PtEBP1的生物信息學分析

根據測序結果，對獲得的PtEBP1進行進一步的序列分析。同源性比對結果顯示，PtEBP1與已報道的沙冬青和馬鈴薯EBP1基因具有較高的同源性，其中與沙冬青EBP1蛋白序列的同源性為89%，與馬鈴薯EBP1蛋白同源性為87%（圖2）。保守結構域分析結果顯示PtEBP1含有1個PA2G4-like-domain，這個結構域屬于APP_MetAP超家族（圖3）。由此推測楊樹PtEBP1基因應屬于轉錄因子APP_MetAP超家族的一個成員。

2.3 PtEBP1表達載體的構建

為對PtEBP1的功能及作用機制進行探究，本試驗進一步對PtEBP1植物表達載體進行構建。首先通過對PtEBP1的序列分析，結合pBI121載體酶切位點信息，確定選用XbaⅠ和SacⅠ對pBI121載體進行切割;隨后設計帶有XbaΙ和SacⅠ切割序列的引物PtEBP1-F：5′-TCTAGAATGTCGTCAGACGACGAGA-3′和PtEBP1-R：5′-GAGCTCCTAGACGGCGGTGG-3′用于擴增PtEBP1，將擴增序列通過T-A克隆方法導入pEASY-T1質粒，挑取陽性克隆并提取質粒，對質粒進行XbaⅠ和SacⅠ雙酶切消化處理后，獲得帶有雙酶切位點的目的片段，與經過同樣雙酶切的pBI121的載體進行連接（圖4）。

上述連接產物轉化大腸桿菌感受態細胞，在含有卡那霉素抗性的LB平板上篩選陽性克隆，PCR檢測顯示陽性重組克隆中含有1.2 kb的目的片段;陽性重組克隆進一步經過XbaⅠ和SacⅠ雙酶切后也能產生1.2 kb的目的片段（圖5）。這表明楊樹EBP1基因已成功構建入植物轉基因表達載體pBI121中。

2.4 農桿菌LBA4404中表達載體的菌液PCR鑒定

采用凍融法將已構建好的表達載體pBI121-PtEBP1轉化農桿菌（LBA4404）感受態細胞，在含有鏈霉素和利福平的YEB固體培養基上進行篩選。隨機挑取4個陽性克隆進行菌液PCR，PCR擴增產物均為1.2 kb（圖6），證明表達載體已成功轉入農桿菌中。

3 結論與討論

EBP1是擬南芥中和人類ErbB-3表皮生長因子受體結合蛋白同源的一個基因，與核糖體的生物合成有關，可以同時控制細胞的分裂和延伸，從細胞數量和體積2個方面同時調控植物器官大小。EBP1基因以劑量依賴型方式調節植物器官大小，同時也以生長素依賴形式對細胞周期調節因子進行調控[12]，該基因與蛋白合成密切相關，并參加調控細胞周期，在調節植物器官大小方面具有重要意義。

楊樹是重要的用材和綠化樹種，具有經濟和生態雙重價值。但和其他絕大多數木本植物一樣，楊樹生長周期也較長，遺傳背景復雜，很難在短時間內創造出大量突變體。因此，長期以來對楊樹等木本植物器官形態建成及生長發育調控機制等基本問題的研究遠遠落后于擬南芥等草本植物。而2006年楊樹全基因組測序的完成[21]及隨后不斷豐富完善的楊樹及其近源種的EST數據信息，為采用生物信息學手段結合反向遺傳學策略探究楊樹生長發育機制等基本問題提供了一條有效途徑。

本研究通過克隆獲得的楊樹PtEBP1基因應屬于轉錄因子APP_MetAP超家族的一個成員。通過蛋白同源性比對發現，楊樹PtEBP1與已報道的與沙冬青、馬鈴薯的EBP1蛋白同源性高達89%、87%。同時，本研究已將楊樹PtEBP1基因構建入植物轉基因表達載體pBI121中，并成功轉入農桿菌LBA4404中，為進一步開展楊樹中EBP1類轉錄因子的功能研究、深度解析楊樹生長發育優勢形成的分子基礎奠定了重要的基礎。

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