線粒體蛋白質組學研究進展

許靜怡　陳超翔　韓錦艷　杭緯　顏曉梅

摘要 線粒體是細胞能量代謝、生物合成和細胞死亡的調控中心，其功能異常會導致許多疾病的產生。線粒體蛋白質組學研究為解析線粒體的生理功能、探索線粒體相關疾病的發病機制及促進線粒體為靶向的藥物研發提供重要理論依據。本文對線粒體蛋白質組學的研究方法，尤其是近年的技術發展以及線粒體蛋白質組學的性質及其應用進行總結，并對其未來的發展前景和挑戰進行展望。

關鍵詞 線粒體； 蛋白質組學； 質譜； 疾??； 評述

1 引 言

線粒體是真核細胞重要的細胞器，其在細胞能量代謝[1]、生物合成和細胞死亡[2，3]（包括細胞凋亡和細胞程序性壞死）的調控中起關鍵作用。此外，線粒體還參與三羧酸循環、脂肪酸和氨基酸氧化、鈣離子穩態調節等重要生理過程[4]。由于線粒體在維持生命穩態中發揮重要作用，因此其功能異常與許多人類疾病相關，如神經退行性疾病、癌癥、心臟病和糖尿病等[5～7]。由于線粒體蛋白質表達異常是其功能紊亂的主要原因，而線粒體蛋白質組學正是從整體角度，分析線粒體的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態等的動態變化，旨在闡明線粒體內全部蛋白質的表達模式和功能模式，包括蛋白質的表達與存在方式（修飾方式）、結構與功能、以及蛋白質相互作用等，從而在蛋白質水平探索線粒體生理功能和相關疾病的聯系[8，9]。通過線粒體蛋白質組學可系統研究正常和病變組織中線粒體蛋白分布與表達的差異，從而為研究線粒體相關疾病的分子機制和以線粒體為靶標的藥物研發奠定理論基礎[10]。近年來，人類基因組測序的完成、串級質譜和蛋白質數據庫的發展加速了線粒體蛋白組學的研究。本文對線粒體蛋白質組學的研究方法，尤其是近年的技術發展進行總結，分析并討論蛋白質組學的性質及其應用。

2 線粒體蛋白質組學的研究方法與技術

2.1 線粒體蛋白質的提取策略

提取大量高純度的線粒體蛋白質是開展線粒體蛋白質組學研究的重要前提[11]，線粒體的純度及其結構的完整性是保障實驗結果準確的關鍵所在。如圖1所示，線粒體由外膜、膜間隙、內膜和基質構成，基質或者膜間隙蛋白質組學可促進線粒體蛋白質的定位和功能研究，但同時也對提取策略的選擇性和特異性提出了更高要求[12]。

差速離心結合密度梯度離心是分離純化線粒體的經典方法[13]。差速離心用于分離不同大小、體積和重量的細胞器[14]。通過差速離心可初步分離得到線粒體，為盡量避免其它細胞器組分的干擾，需通過密度梯度離心對得到的線粒體進一步分離純化[15]。密度梯度離心是在離心管內通過特定介質形成連續或不連續的密度梯度，將差速離心得到的線粒體懸液置于介質頂部，懸液通過重力或離心力場作用進一步分層和分離。線粒體密度梯度離心常用介質有氯化銫、蔗糖、Ficoll、Percoll及碘化介質（如Nycodenz）等。其中蔗糖黏度大且滲透性高， 易使細胞器破裂；而Percoll和Nycodenz介質形成的梯度十分穩定，且不易穿透生物膜造成細胞器損傷。例如，2010年Ferreira等利用Percoll為介質的密度梯度離心法提取小鼠的腓腸骨骼肌中肌膜和肌纖維線粒體進行線粒體蛋白質組學研究[16]。2014年Chen等利用以Nycodenz為介質的密度梯度離心法對卵巢癌中有阿霉素抗性與無阿霉素抗性的兩個細胞系分別提取線粒體，分離鑒定后發現，122種蛋白質在有阿霉素抗性的細胞系中表達量顯著變化[17]。提取線粒體的純度和完整性通常采用形態學觀察、特定抗體檢測或特定酶活性檢測等方法進行分析。電鏡可直觀地觀察線粒體形態及結構的完整性，采用免疫印跡法分析線粒體標志性蛋白如外膜VDAC、膜間隙細胞色素C蛋白的豐度可進一步證明膜結構的完整性。此外，通過測定線粒體標志性酶如琥珀酸脫氫酶的活性及與其它細胞器標志酶的活性比較可檢測提取線粒體的純度。近年來，本課題組采用線粒體內膜心磷脂特異性熒光探針（NAO）和核酸探針（SYTO 62）（與線粒體DNA結合）對線粒體進行標記，利用其自行研發的超高靈敏流式檢測裝置（High sensitivity flow cytometer， HSFCM）在單顆粒水平對雙熒光標記的線粒體進行檢測，通過散射光通道與兩個熒光通道信號的時間相關性可定量分析所提取線粒體的純度和結構完整性并能從單細胞器水平揭示線粒體的異質性[18]。

然而，通過上述分級分離技術獲得的線粒體蛋白不僅由于細胞器粘連導致純度較低，容易損失或受到污染，而且難以特異地檢測線粒體各個亞區間（基質、膜間隙）的蛋白質[11]。為了實現線粒體亞區間蛋白質的特異提取，美國MIT大學的Ting課題組對抗壞血酸過氧化物酶（APEX）進行基因改造，可特異地“釣到”膜間隙或基質蛋白質[19]。如圖2所示，基因工程改造的APEX可靶向線粒體基質、氧化多種苯酚衍生物產生羥基自由基，這些自由基壽命短（<1 ms）[20]，標記半徑?。?lt;20 nm）[21，22]，可與富電子氨基酸例如Tyr， Trp， His等共價結合，從而標記鄰近蛋白質[23]。通過該方法可鑒定HEK細胞線粒體基質的495種蛋白質，其中31種是新發現的蛋白質[24]。采用該方法捕獲的基質蛋白組覆蓋率和特異性分別達到85%和94%，覆蓋率較低的原因可能是一些蛋白質側鏈被包埋太致密而無法與羥基自由基作用。該課題組又進一步通過APEX結合細胞培養穩定同位素標記方法（SILAC）[25] 提取和鑒定線粒體膜間隙蛋白組，共鑒定了127種膜間隙蛋白質（其中9種蛋白為新發現的線粒體蛋白），特異性高達94%，實現了對線粒體膜間隙蛋白質組的高效測定[26]。

圖2 標記活細胞的線粒體基質蛋白質組[24]

Fig.2 Labeling the mitochondrial matrix proteome in living cells[24] （Adapted from Ref.[24]， with kind permission from Science）

綜上所述，獲得線粒體總蛋白質的經典方法是采用差速離心結合密度梯度離心提取線粒體，裂解之后進行分離和質譜分析，該提取策略促進了線粒體總蛋白質“目錄”的建立。Ting課題組創新性地通過APEX與基質或膜間隙靶向序列的融合表達，特異獲取線粒體基質或膜間隙蛋白組，省略了提取細胞器這一繁瑣步驟，實現對線粒體亞區間蛋白質的特異性提取和鑒定，促進了新蛋白的發現、蛋白質的亞線粒體定位和亞區間蛋白質功能研究，使蛋白質組學邁入了 “細胞器亞區間”時代。

2.2 線粒體蛋白質的分離策略

對于線粒體蛋白質組學研究，無論通過上述何種策略獲得線粒體蛋白質組，都需要對蛋白質混合物進行分離，分離后酶解成多肽片段，再通過質譜進行鑒定。分離線粒體蛋白質混合物的方法主要是電泳和色譜法。

二維電泳是分離線粒體蛋白質最廣泛最經典的方法，它是一種高分辨率的蛋白質分離技術。二維凝膠電泳的第一相常為等電聚焦電泳（IEF），根據蛋白質等電點的不同進行分離；第二相是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），根據蛋白質分子量的不同進行分離。1998年Rabilloud等首先利用IEF/SDSPAGE分離人胚胎組織線粒體蛋白質并結合肽指紋圖譜鑒定了46種線粒體蛋白質[27]。王媛等通過雙向凝膠電泳在小鼠心臟、肝臟和腎臟3種組織中發現了87種組織特異的差異蛋白[28]。此外，有報道采用雙向熒光差異凝膠電泳（2DDIGE）分析蛋白表達量的變化，即利用不同熒光染料標記不同處理方法的蛋白質，再等量混合標記不同熒光染料的蛋白質進行雙向電泳，通過熒光強度的變化可測定蛋白表達量的變化。如van Laar等提取小鼠腦線粒體并分成有無多巴胺醌處理的兩組，通過2DDIGE結合質譜分析發現18種蛋白質的表達量發生顯著變化[29]。RamírezTorres等分別提取兩組膳食中“含”與“不含”鯊烯的小鼠肝臟線粒體，利用2DDIGE分離蛋白質結合質譜分析，發現鯊烯處理的小鼠肝臟線粒體中有18種蛋白質表達量發生改變[30]。然而， IEF/SDSPAGE技術難以分離強酸性、強堿性、相對分子質量過大或過小的蛋白質或者膜蛋白和一些低豐度蛋白質等。通過藍綠溫和非變性凝膠電泳（BNPAGE）結合SDSPAGE可以彌補IEF/SDSPAGE的技術缺陷，可分離線粒體膜蛋白復合物等。該技術是在非變性狀態下根據相對分子質量分離膜蛋白復合體且不改變膜蛋白復合物的生理活性和結合狀態，再通過SDSPAGE將各個復合物的亞基或蛋白質分離出來。Ferreira等通過綜合使用2DIEF/SDSPAGE/MS/MS和2DBN/SDSPAGE/MS/MS對腓腸骨骼肌中肌膜和肌纖維的線粒體蛋白質進行分離和鑒定，識別325種線粒體蛋白質[16]。Chou等綜合BN/SDSPAGE和IEF/SDSPAGE兩種分離方法對小鼠的大腦皮質線粒體蛋白質進行分離并結合質譜分析，發現23種與三羧酸循環（TCA）相關蛋白質在AD模型小鼠中表達失調[31]。

色譜是將線粒體蛋白質用蛋白酶水解后，根據不同多肽在流動相和固定相之間的分配系數不同，使其在兩相間反復多次分配，以不同速度遷移，從而分離不同肽段。多維液相色譜組合了兩種或兩種以上不同分離機制，根據樣品不同特性（如分子大小、親水性、等電點等）對混合多肽進行分離。多維液相色譜具有快速、高通量、自動化、重現性高等優點，且能夠檢測疏水性以及低豐度蛋白質，但難以提供翻譯后修飾等信息[32]。

通過將凝膠電泳與色譜兩種策略以合理方式組合，可使混合物達到更好分離效果。即先將線粒體的蛋白混合物通過SDSPAGE分離并切割條帶水解成多肽，最后用一維或多維液相色譜串聯質譜來鑒定水解得到的肽段。例如，Techritz等從鼠腦、骨骼肌、心臟、肝臟和腎五種組織中提取線粒體并純化，通過IEF/SDSPAGE和LC/ESIMS及MS/MS分離鑒定，發現有48種蛋白質在不同組織中存在不同表達程度[33]。

2.3 線粒體蛋白質的鑒定

質譜是鑒定蛋白質的首選方法，其可以準確測量肽段和蛋白質的分子量、氨基酸序列及翻譯后修飾等信息。目前，根據蛋白質或多肽分子離子化的方式不同可分為電噴霧離子化質譜（ESIMS）和基質輔助激光解吸離子化質譜（MALDIMS）。MALDI產生的離子可以用飛行時間質量分析器（TOF）檢測，即基質輔助激光解吸飛行時間質譜（MALDITOFMS）。MALDITOFMS可以檢測肽段的分子量，獲得蛋白質的肽質量指紋圖譜（PMF），通過與相應的線粒體蛋白質數據庫比對來鑒定蛋白質[34]。此外，通過串級質譜技術（MS/MS）可對質譜分析的肽段進行碎裂再用質譜分析，從而得到肽段序列信息。質譜技術還可與雙向凝膠電泳、二維液相色譜等蛋白質或肽段分離技術聯用，實現“在線”式分離鑒定蛋白質，具有靈敏度高、準確度高和自動化程度高的優點。如Taylor等通過蔗糖密度梯度法提取人心臟線粒體，利用SDSPAGE結合質譜和生物信息學分析，識別615種線粒體蛋白質，這些蛋白質主要參與生物合成，離子轉運及脂代謝[35]。Lamb等通過LCMS/MS發現40種以上線粒體蛋白質在癌干細胞中表達量無限上調[36]。Mootha等通過串級質譜技術LCMS/MS鑒定來自小鼠腦、心臟、腎、肝臟的399種線粒體蛋白質[37]。但這些檢測到的大部分是高豐度蛋白質，隨著串聯質譜技術靈敏度等的提高，也促進了低豐度蛋白質的檢測。如Pagliarini等提取小鼠的14種組織結合MS/MS技術鑒定了3881種線粒體蛋白質[38]。因為2DDIGE在樣品處理上費時費力，不利于大規模的蛋白質組定量，而通過同位素標記、化學標記（ICAT或iTRAQ）或label free方法，質譜也可定量分析線粒體蛋白組的改變。例如，Bugger等通過label free方法和LCMS/MS發現心衰過程中脂肪酸氧化酶表達量減少，而丙酮酸脫氫酶亞基和兩種TCA循環關鍵酶表達量均上調，實現對線粒體蛋白組的定量分析[39]。為了探索氧含量對神經元線粒體功能的影響，Villeneuve等分別提取5%和21%氧含量培養SHSY5Y（神經母細胞瘤細胞）的線粒體，利用同位素標記結合IEFPAGE及LCMS/MS分離鑒定蛋白質，鑒定出714種線粒體蛋白質，且5%氧含量培養的細胞的線粒體呼吸鏈復合物亞基等顯著高于21%氧含量培養的細胞，前者所產生的活性氧水平也低于后者，說明SHSY5Y更適合在5%氧含量條件下培養[40]。線粒體蛋白質的合成與降解過程之間的動態平衡是維持線粒體穩態的重要因素，因此Kim等通過重水標記策略結合SDSPAGE， LCMS， MS/MS分離鑒定來自鼠心臟和肝臟485種“轉換蛋白質”。實驗結果表明， 肝線粒體蛋白質轉換速率快于心臟組織，這些信息可以促進線粒體蛋白翻譯及穩態維持的機理研究[41]。

顯微鏡技術是與質譜互補的蛋白質鑒定方法，其主要作用是對線粒體蛋白質進行定位分析，即通過熒光標記抗體或者轉染熒光蛋白（如GFP）等進行觀察，已成功運用于酵母菌的線粒體蛋白質組學研究[42，43]。2013年Techritz等[33]從鼠腦、骨骼肌、心臟、肝臟和腎5種組織中提取線粒體，質譜鑒定后再結合顯微鏡觀察GFP標記的蛋白質，識別了6種新的線粒體蛋白質。該技術的缺陷在于高質量抗體的數量和種類有限，轉染實驗周期較長且引入外源蛋白質，只能對少量幾種蛋白進行觀察，無法實現高通量分析[44]。

總之，質譜和顯微鏡技術的發展促進了線粒體蛋白質組學的研究，既可進行高通量分析，也可選擇性地觀察目標蛋白，促進未知線粒體蛋白的發現，完善線粒體蛋白組的“目錄”，也使線粒體蛋白質組學在相關疾病的研究中得以應用。

3 線粒體蛋白質組學的性質及其應用

隨著線粒體蛋白質組提取、分離和鑒定技術的發展，目前已建立了較為完善的線粒體蛋白質“目錄”。已檢測到1000多種人類線粒體蛋白質[8]，并發現線粒體蛋白質的豐度變化非常大，最豐富的內膜和外膜蛋白分別是ANT1和VDAC[45]。以下對線粒體蛋白質組的蛋白數目、豐度、定位、翻譯后修飾、組織分布、生化途徑歸屬及其應用進行介紹。

在線粒體蛋白質的定位方面，一部分蛋白質只存在于線粒體中，而另一部分線粒體蛋白質可以“雙重”定位，即同一基因編碼的蛋白質除了定位于線粒體，還出現在胞質或其它細胞器中[46]。如在凋亡信號刺激下，tBID被凋亡蛋白酶8切割后轉位到線粒體外膜上[47]；線粒體膜間隙細胞色素C借助凋亡蛋白Bax等形成的孔道轉位到胞漿[48]。

在線粒體蛋白質的翻譯后修飾方面，主要采用3種方式：乙?；?、磷酸化和羥基化。SIRT3是依賴NAD+的線粒體去乙?；?，為了解其作用底物，Rardin等利用Label free定量方法檢測到小鼠肝臟組織中483種乙?；€粒體蛋白質，2187個賴氨酸乙?；稽c，且發現136種蛋白質中283個乙?；稽c在SIRT3基因敲除小鼠模型中顯著上調，說明SITR3可對多種蛋白質以及同一種蛋白質上的多個位點去乙?；?。進一步分析發現， 這些乙?；€粒體蛋白質主要參與脂肪酸氧化、TCA循環等，表明SITR3是一種廣譜的線粒體蛋白質去乙?；竅49]。Grimsrud等通過對不同生理狀態小鼠肝臟磷酸化線粒體蛋白組進行多參數分析，結合iTRAQ定量標記策略及LCMS/MS技術分離鑒定磷酸化多肽，共識別295種磷酸化線粒體蛋白質，包括811個磷酸化位點，且這些線粒體蛋白質的磷酸化在肥胖癥及T2D相關的酮體合成中起重要調節作用[50]。Deng等提取T2D模型小鼠的肝臟線粒體，通過LCMS/MS技術分離鑒定出355種羥基化線粒體蛋白質，且羥基化程度在T2D病變過程中顯著提高，這種高程度的羥基化與ROS過量產生和氧化應激相關，可加速凋亡速率，這些蛋白質組學研究也促進了T2D發病機理探索和藥物研發[51]?？傊?，線粒體蛋白質組學技術與方法的發展促進動態可逆的蛋白質翻譯后修飾的研究。

在線粒體蛋白質的組織分布方面，由于不同組織對線粒體的功能需求不同，如肝臟主要需要生物合成功能，而心臟主要需要能量代謝功能，因而線粒體蛋白質在不同組織中分布不同。如Johson等分別提取小鼠的腦、肝臟、心臟和腎臟線粒體，通過LCMS鑒定識別1162種高信任度線粒體蛋白質，然而任意兩種組織間有1149種蛋白質顯著不同，4種組織中僅有13種蛋白質相同，說明線粒體蛋白質組的組織分布差異巨大[52]。Lotz等分別提取人心肌、小鼠心肌、小鼠肝臟組織及果蠅線粒體，利用SDSPAGE、LCMS/MS和光譜分析分別識別1398， 1620， 1733和1015種線粒體蛋白質，4種體系中僅有419種蛋白質高度保守，且這些蛋白質表達量動態范圍大（跨越5個數量級），高豐度蛋白主要與氧化磷酸化、代謝、信號轉導和蛋白轉運等相關[53]。且研究發現，呼吸鏈復合物Ⅰ， Ⅱ， Ⅲ和Ⅴ在所有組織中高豐度分布，然而復合物IV在不同組織中分布不同[54]?？傊?，線粒體蛋白質組學的研究揭示了線粒體蛋白質在不同組織或種屬間分布差異大，不同組織的線粒體蛋白質組學研究可以促進相關疾病的研究和治療。

在線粒體蛋白質的生化途徑歸屬方面，以人的正常心臟組織為例（如圖3所示）[35]，在所識別的498種線粒體蛋白質中，與氧化磷酸化功能相關蛋白質數目最多，占17%，信號轉導相關的占12%，生物合成相關的占11%，與核苷酸代謝功能相關的數目最少，占1%，說明線粒體在能量代謝、生物合成及信號轉導中起著重要的調控作用。

圖3 人心臟組織線粒體蛋白質功能與分布[35]

Fig.3 Distribution and function of human heart mitochondrial proteins[35]

線粒體蛋白質組學的發展對線粒體相關疾病的研究起到了積極的推動作用。例如，線粒體氧化磷酸化受阻，將導致呼吸鏈疾?。≧CD），患病率約0.02%，臨床特征包含骨骼肌病變、心肌癥、癲癇、中風、失明和內分泌紊亂等，通過線粒體蛋白組學研究已發現92種蛋白質突變與RCD相關[55]。在退行性疾病方面，通過線粒體蛋白質組學研究發現復合物I功能失調與帕金森疾?。≒D）相關，其參與蛋白折疊和細胞凋亡，促進了PD發病機制的研究[56]。在癌癥方面，Kim等在人胃癌細胞系AGS線粒體蛋白組研究中發現4種高表達的線粒體蛋白質[57]；Chen等利用2DDIGE結合MALDITOFMS對不同的乳腺癌細胞系的線粒體蛋白組進行研究[58]，促進了腫瘤細胞線粒體生物標記物的發現。在心血管疾病方面，通過線粒體蛋白質組學研究可闡明壓力負荷誘導心衰[39]、缺血性心衰、以及慢性缺氧疾病的發病機制[59， 60]。在肝病方面，Eccleston等發現高脂肪膳食導致線粒體蛋白組改變，其與脂肪變性、NO合成及代謝有關[61]。在衰老方面，Alves等通過電泳和質譜串聯技術對有無運動的骨骼肌線粒體蛋白組研究，說明運動是改善衰老和維持線粒體功能的重要調節因素[62]。

在藥物研發方面，由于癌細胞抗藥性的產生使癌癥治療效果大大降低。Chen等通過SILAC和LCMS/MS技術發現122種線粒體蛋白質在對阿霉素抗性的卵巢癌細胞系中表達量顯著改變，分析表明線粒體是改善抗藥性的重要靶點[17]。Chappell等通過線粒體蛋白質組學研究發現抗藥性細胞系中線粒體蛋白質表達量的改變與凋亡規避、腫瘤侵染和轉移等生理活動相關[63]。線粒體蛋白質組學也可用于藥物副作用的研究，Lee等通過iTRAQ定量并結合2DLC分離、MALDITOF/TOF MS/MS鑒定線粒體蛋白質，說明曲格列酮會損傷線粒體功能[64]。綜上所述，線粒體蛋白質組學的發展促進了線粒體相關疾病的發病機制的系統研究和藥物研發。

4 結論與展望

隨著線粒體蛋白質組提取、分離和鑒定技術的發展，目前既能對整個線粒體蛋白質組進行分析，也可針對膜間隙或基質亞區間蛋白質組分析，進一步完善線粒體蛋白質組學的“目錄”。蛋白質組學的發展為我們提供了大量線粒體基因和蛋白信息，通過結合臨床特征，有利于發現與疾病相關的基因和蛋白，為我們系統研究線粒體與人類疾病的關系奠定基礎。線粒體蛋白質組學需要在以下幾個方向進一步發展：第一，進一步完善線粒體蛋白組目錄。一些蛋白質可能由于豐度太低無法使用傳統方法檢測，一些蛋白質由于側鏈包埋于封閉結構中而無法對其進行生物素化檢測。因此需要改進實驗技術與方法，提高線粒體蛋白質提取方法的覆蓋率和特異性，鑒定、識別之前難以檢測的蛋白質；第二，除鑒定線粒體蛋白質的氨基酸序列，還需完善蛋白質翻譯后修飾和線粒體亞區間定位等信息，因為這些信息與蛋白質自身功能緊密相關；第三，通過RNA干擾、蛋白蛋白相互作用、理論計算結合數據庫等方法研究蛋白質在線粒體能量代謝、生物合成、細胞死亡中所起的作用（功能預測）；最后，借助生物及化學的新技術、新方法和數據庫資源等將線粒體蛋白質組學中蛋白質序列突變等信息與線粒體的生理功能和相關疾病的臨床特征及特定表型關聯起來，這不僅對于線粒體相關疾病發病機理的研究和藥物研發意義重大，而且也正是發展線粒體蛋白質組學的目的所在?？偠灾?，線粒體蛋白質組學對線粒體全部蛋白質的“破譯”將會為人類疾病研究和線粒體生物學開辟一個嶄新時代。

References

1 Wagner B K， Kitami T， Gilbert T J， Peck D， Ramanathan A， Schreiber S L， Golub T R， Mootha V K. Nat. Biotechnol.， 2008， 26： 343-351

2 Soriano M E， Scorrano L. Cell， 2011， 145（1）： 15-17

3 Hengartner M O. Nature， 2000， 407： 770-776

4 Detmer S A， Chan D C. Nat. Rev. Mol. Cell Biol.， 2007， 8（11）： 870-879

5 Heller A， Brockhoff G， Goepferich A. Eur. J. Pharm. Biopharm.， 2012， 82（1）： 1-18

6 Abramov A Y， SmuldersSrinivasan T K， Kirby D M， AcinPerez R， Enriquez J A， Lightowlers R N， Duchen M R， Turnbull D M. Brain， 2010， 133： 797-807

7 Weinberg S E， Chandel N S. Nat. Chem. Biol.， 2015， 11（1）： 9-15

8 Calvo S E， Mootha V K. Annu. Rev. Genom. Hum. G， 2010， 11： 25-44

9 Wallace D C， Fan W， Procaccio V. Annu. Rev. Pathol. Mech.， 2010， 5： 297-348

10 Jiang Y J， Wang X. J. Hematol. Oncol.， 2012， 5： 1-13

11 Forner F， Foster L J， Campanaro S， Valle G， Mann M. Mol. Cell Proteomics， 2006， 5（4）： 608-619

12 Bardel J， Louwagie M， Jaquinod M， Jourdain A， Luche S， Rabilloud T， Macherel D， Garin J， Bourguignon J. Proteomics， 2002， 2（7）： 880-898

13 Stimpson S E， Coorssen J R， Myers S J. Anal. Biochem.， 2015， 475： 1-3

14 Foster L J， de Hoog C L， Zhang Y， Zhang Y， Xie X， Mootha V K， Mann M. Cell， 2006， 125（1）： 187-199

15 Hartwig S， Feckler C， Lehr S， Wallbrecht K， Wolgast H， MüllerWieland D， Kotzka J. Proteomics， 2009， 9（11）： 3209-3214

16 Ferreira R， Vitorino R， Alves R M， Appell H J， Powers S K， Duarte J A， Amado F. Proteomics， 2010， 10（17）： 3142-3154

17 Chen X L， Wei S S， Ma Y， Lu J， Niu G， Xue Y H， Chen X Y， Yang F Q. Theranostics， 2014， 4（12）： 1164-1175

18 Zhang S Y， Zhu S B， Yang L L， Zheng Y， Gao M， Wang S， Zeng J Z， Yan X M. Anal. Chem.， 2012， 84（15）： 6421-6428

19 Martell J D， Deerinck T J， Sancak Y， Poulos T L， Mootha V K， Sosinsky G E， Ellisman M H， Ting A Y. Nat. Biotechnol.， 2012， 30： 1143-1148

20 Mortensen A， Skibsted L H. J. Agr. Food Chem.， 1997， 45（8）： 2970-2977

21 Bendayan M. Science， 2001， 291： 1363-1365

22 Mayer G， Bendayan M. J. Histochem. Cytochem.， 1997， 45： 1449-1454

23 Minamihata K， Goto M， Kamiya N. Bioconjugate. Chem.， 2011， 22（11）： 2332-2338

24 Rhee H W， Zou P， Udeshi N D， Martell J D， Mootha V K， Carr S A， Ting A Y. Science， 2013， 339： 1328-1331

25 Geiger T， Cox J， Ostasiewicz P， Wisniewski J R， Mann M. Nat. Methods， 2010， 7： 383-385

26 Hung V， Zou P， Rhee H W， Udeshi N D， Cracan V， Svinkina T， Carr S A， Mootha V K， Ting A Y. Mol. Cell， 2014， 55： 332-341

27 Rabilloud T， Kieffer S， Procaccio V， Louwagie M， Courchesne P L， Patterson S D， Martinez P， Garin J， Lunardi J. Electrophoresis， 1998， 19（6）： 1006-1014

28 WANG Yuan， SUN HaiDan， RU YaWei， YIN Liang， LIU SiQi. Science China： Lift Sci.， 2010， 9： 820-833

王 媛， 孫海丹， 茹雅維， 尹松月， 陰 亮， 劉斯奇. 中國科學： 生命科學， 2010， 9： 820-833

29 van Laar V S， Dukes A A， Cascio M， Hastings T G. Neurobiol. Dis.， 2008， 29（3）： 477-489

30 RamirezTorres A， BarceloBatllori S， FernandezVizarra E， Navarro M A， Arnal C， Guillen N， Acin S， Osada J. J. Proteomics， 2012， 75（9）： 2563-2575

31 Chou J L， Shenoy D V， Thomas N， Choudhary P K， Laferla F M， Goodman S R， Breen G A. J. Proteomics， 2011， 74（4）： 466-479

32 Wu Q， Yuan H， Zhang L， Zhang Y. Anal. Chim. Acta， 2012， 731： 1-10

33 Techritz S， Lutzkendorf S， Bazant E， Becker S， Klose J， Schuelke M. Proteomics， 2013， 13（1）： 179-195

34 Chang H W， Chuang L Y， Cheng Y H， Gu D L， Huang H W， Yang C H. Genetic Variation. Springer Press， 2010： 259-274

35 Taylor S W， Fahy E， Zhang B， Glenn G M， Warnock D E， Wiley S， Murphy A N， Gaucher S P， Capaldi R A， Gibson B W， Ghosh S S. Nat. Biotechnol.， 2003， 21： 281-286

36 Lamb R， Harrison H， Hulit J， Smith D L， Lisanti M P， Sotgia F. Oncotarget， 2014， 5： 11029-11037

37 Mootha V K， Bunkenborg J， Olsen JV， Hjerrild M， Wisniewski J R， Stahl E， Bolouri M S， Ray H N， Sihag S， Kamal M， Patterson N， Lander ES， Mann M. Cell， 2003， 115（5）： 629-640

38 Pagliarini D J， Calvo S E， Chang B， Sheth S A， Vafai S B， Ong S E， Walford G A， Sugiana C， Boneh A， Chen W K， Hill D E， Vidal M， Evans J G， Thorburn D R， Carr S A， Mootha V K. Cell， 2008， 134（1）： 112-123

39 Bugger H， Schwarzer M， Chen D， Schrepper A， Amorim PA， Schoepe M， Nguyen T D， Mohr F W， Khalimonchuk O， Weimer B C， Doenst T. Cardiovasc Res.， 2010， 85（2）： 376-384

40 Villeneuve L， Tiede L M， Morsey B， Fox H S. J. Proteome. Res.， 2013， 12（10）： 4599-4606

41 Kim T Y， Wang D， Kim A K， Lau E， Lin A J， Liem D A， Zhang J， Zong N C， Lam M P， Ping P. Mol. Cell Proteomics， 2012， 11（12）： 1586-1594

42 Kumar A， Agarwal S， Heyman J A， Matson S， Heidtman M， Piccirillo S， Umansky L， Drawid A， Jansen R， Liu Y， Cheung K H， Miller P， Gerstein M， Roeder GS， Snyder M. Gene Dev.， 2002， 16（6）： 707-719

43 Huh W K， Falvo J V， Gerke L C， Carroll A S， Howson R W， Weissman J S， O'Shea E K. Nature， 2003， 425： 686-691

44 Ozawa T， Sako Y， Sato M， Kitamura T， Umezawa Y. Nat. Biotechnol.， 2003， 21： 287-293

45 Vieira H L， Haouzi D， El Hamel C， Jacotot E， Belzacq A S， Brenner C， Kroemer G. Cell Death Differ.， 2000， 7（12）： 1146-1154

46 Tong W H， Rouault T. EMBO J， 2000， 19： 5692-5700

47 Zaltsman Y， Shachnai L， YivgiOhana N， Schwarz M， Maryanovich M， Houtkooper R H， Vaz F M， De Leonardis F， Fiermonte G， Palmieri F， Gillissen B， Daniel P T， Jimenez E， Walsh S， Koehler C M， Roy S S， Walter L， Hajnoczky G， Gross A. Nat. Cell Biol.， 2010， 12（6）： 553-562

48 Chen T T， Tian X， Liu C L， Ge J， Chu X， Li Y F. J. Am. Chem. Soc.， 2015， 137（2）： 982-989

49 Rardin M J， Newman J C， Held J M， Cusack M P， Sorensen D J， Li B， Schilling B， Mooney S D， Kahn C R， Verdin E， Gibson B W. Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2013， 110（16）： 6601-6606

50 Grimsrud P A， Carson J J， Hebert A S， Hubler S L， Niemi N M， Bailey D J， Jochem A， Stapleton D S， Keller M P， Westphall M S， Yandell B S， Attie A D， Coon J J， Pagliarini D J. Cell Metab.， 2012， 16（5）： 672-683

51 Deng W J， Nie S， Dai J， Wu J R， Zeng R. Mol. Cell Proteomics， 2010， 9（1）： 100-116

52 Johnson D T， Harris R A， French S， Blair PV， You J， Bemis K G， Wang M， Balaban R S. Am. J. PhysiolCell Ph.， 2007， 292（2）： C689-C697

53 Lotz C， Lin A J， Black C M， Zhang J， Lau E， Deng N， Wang Y， Zong NC， Choi J H， Xu T， Liem D A， Korge P， Weiss J N， Hermjakob H， Yates JR， 3rd， Apweiler R， Ping P. J. Proteome Res.， 2014， 13（2）： 433-446

54 Capaldi R A， Halphen D G， Zhang Y Z， Yanamura W. J Bioenerg. Biomembr.， 1988， 20（3）： 291-311

55 Kirby D M， Thorburn D R. Twin Res. Hum. Genet.， 2008， 11（4）： 395-411

56 Burte F， de Girolamo L A， Hargreaves A J， Billett E E. J. Proteome. Res.， 2011， 10（4）： 1974-1986

57 Kim H K， Park W S， Kang S H， Warda M， Kim N， Ko J H， Prince Ael B， Han J. Am. J. PhysiolCell Ph.， 2007， 293（2）： C761-C771

58 Chen Y W， Chou H C， Lyu P C， Yin H S， Huang F L， Chang W S， Fan C Y， Tu I F， Lai T C， Lin S T， Lu Y C， Wu C L， Huang S H， Chan HL. Funct. Integr. Genomic.， 2011， 11（2）： 225-239

59 Vigano A， Vasso M， Caretti A， Bravata V， Terraneo L， Fania C， Capitanio D， Samaja M， Gelfi C. Proteomics， 2011， 11： 4202-4217

60 Liu T， Chen L， Kim E， Tran D， Phinney B S， Knowlton A A. Life Sci.， 2014， 101： 27-36

61 Eccleston H B， Andringa K K， Betancourt A M， King A L， Mantena S K， Swain T M， Tinsley H N， Nolte R N， Nagy T R， Abrams G A， Bailey S M. Antioxid. Redox. Sign.， 2011， 15（2）： 447-459

62 Alves R M， Vitorino R， Figueiredo P， Duarte J A， Ferreira R， Amado F. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci.， 2010， 65（8）： 832-842

63 Chappell N P， Teng P N， Hood B L， Wang G， Darcy K M， Hamilton C A， Maxwell G L， Conrads T P. J. Proteome. Res.， 2012， 11（9）： 4605-4614

64 Lee Y H， Bin Goh W W， Ng C K， Raida M， Wong L， Lin Q S， Boelsterli U A， Chung M C M. J. Proteome. Res.， 2013， 12（6）： 2933-2945