乙型肝炎表面抗原陽性對免疫抑制狀態下小鼠肝癌復發的影響

高偉，葛亮（.天津市第一中心醫院器官移植中心，天津 3009； .天津市兒童醫院，天津 300074）

供體缺乏已成為制約肝移植發展的主要瓶頸。邊緣供肝的使用是目前擴大供體來源的主要方式之一。目前國內外均有應用乙型肝炎表面抗原（HBsAg）陽性供肝行肝移植術的研究報道，證實了HBsAg陽性供肝的安全性［1-3］。本中心曾嘗試應用HBsAg陽性供肝治療晚期肝癌患者，但術后隨訪患者均死于肝癌復發，因此HBsAg陽性供肝是否會促進肝癌患者腫瘤復發仍需進一步驗證。本實驗建立乙型肝炎病毒（HBV）轉基因小鼠移植性肝癌模型，對其進行免疫抑制藥物干預，比較免疫抑制狀態下血清學HBsAg陽性與陰性小鼠肝臟腫瘤的復發及進展，為臨床應用HBsAg陽性供肝進行肝移植治療以挽救晚期肝癌患者的可行性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 實驗動物：Balb/c雄性小鼠30只，8～10周齡，體重18～22 g，購于天津市奧易德實驗用品有限公司。HBV轉基因Balb/c雄性小鼠30只，8～10周齡，體重18～22 g，購于中國人民解放軍第四五八醫院。

1.1.2 主要試劑：小鼠肝癌H22腹腔積液型腫瘤細胞株（購于北京銀紫晶生物醫藥技術有限公司），甲潑尼龍琥珀酸鈉（購于美國輝瑞公司），環孢素A（購于瑞士諾華制藥公司），增殖細胞核抗原（PCNA）抗體（購于美國Epitomics公司），血管內皮生長因子（VEGF）抗體（購于美國Epitomics公司），細胞間黏附分子-1（ICAM-1）抗體（購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 實驗分組：30只雄性HBV轉基因Balb/c小鼠為實驗組，30只普通雄性Balb/c小鼠為對照組，分別于術后1、2、3周處死小鼠，每組每次為10只。

1.2.2 腫瘤細胞的制備：從液氮中取出凍存的小鼠H22肝癌細胞株，常規復蘇，用生理鹽水調整腫瘤細胞濃度為1×107個/ml，無菌條件下用1ml BD注射器直接注入Balb/c小鼠腹腔0.1 ml（細胞數為1×106個）。小鼠接種H22肝癌細胞9天后無菌抽取癌性腹腔積液，錐蟲藍染色，顯微鏡下觀察腫瘤細胞存活率＞95%，常規計數細胞，生理鹽水調整腫瘤細胞濃度為2×107個/ml，4℃備用。

1.2.3 手術過程：稱量小鼠體重，用5%水合氯醛（5 ml/kg）進行腹腔麻醉。麻醉滿意后，以仰臥位用膠帶將其固定于手術臺上，切口周圍備皮，并以安爾碘消毒。于腹正中線偏左作一長約0.8 cm左右的縱形切口，無菌棉棒充分暴露脾臟，用1 ml BD注射器于小鼠脾包膜下注入已制備好H22肝癌細胞株0.05 ml，細胞數為1×106個，緩慢退出針頭，并在針眼處用無菌棉棒壓迫5～10分鐘，防止出血，觀察無出血后逐層縫合關腹。

1.2.4 術后管理：術后給予自由飲食、飲水；仍以普通飼料為飲食，飲自來水。術后每天給予腹腔注射環孢素A 5 mg /（kg·d）、甲潑尼龍琥珀酸鈉10 mg /（kg·d），模擬移植術后免疫抑制狀態。

1.2.5 術后取材：分別于術后1、2、3周稱量體重；眼球摘除法取血，檢測血清HBsAg表達。剖腹觀察肝臟腫瘤復發率、腫瘤大小、腫瘤數量；取下肝臟稱重，置于4%甲醛水溶液固定，用于病理學檢查及免疫組化染色。

本實驗中動物處置方法符合動物倫理學標準。

1.2.6 指標檢測及方法

1.2.6.1 肝癌復發觀察分級：Ⅰ級，單個小的瘤灶1～5個（直徑均在1 mm以下）；Ⅱ級，小的瘤灶在肺內彌散分布，6～10個或單個中等轉移灶（直徑在1～2 mm之間）；Ⅲ級，小的轉移灶呈廣泛分布（幾乎所有肝葉），或存在幾個大的轉移灶（直徑在2 mm以上）。

1.2.6.2 HBsAg檢測、肝組織病理學觀察及PCNA、VEGF、ICAM-1的表達檢測：血清HBsAg檢測采用ELISA試劑盒；肝組織病理標本以常規蘇木素-伊紅（HE）染色；應用免疫組化檢測肝組織中PCNA、VEGF及ICAM-1的表達。分別計算陽性指數：高倍鏡下取5個不同視野，各計數100個癌細胞，計算陽性細胞所占百分率。采用評分標準［4］：A為陽性細胞所占百分率分級：0%～1%＝0分、1%～10%＝1分、10%～50%＝2分、50%～80%＝3分、80%～100%＝4分；B為陽性細胞顯色強度分級：0分（陰性）、1分（弱陽性；淡黃色）、2分（陽性；棕黃色）、3分（強陽性；棕褐色）。免疫反應積分（IHS）＝A×B。

1.3 統計方法：采用SPSS 17.0統計軟件對數據進行處理。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗或單因素方差分析；計數資料用率表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組小鼠不同時間點術前體重、處死時體重及肝臟的重量（表1）：實驗組與對照組術后1、2、3周術前體重（P值分別為0.16、0.27、0.07）、處死時體重（P值分別為0.48、0.96、0.73）與肝臟重量（P值分別為0.29、0.41、0.20）比較差異均無統計學意義。

表1 兩組小鼠不同時間點術前體重、處死時體重及肝臟重量的比較

2.2 兩組小鼠不同時間點腫瘤復發情況（表2）實驗組與對照組術后1、2、3周腫瘤復發率（P值分別為1、0.653、0.606）及腫瘤復發程度分級比較（P值分別為1、0.935、0.952）差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

表2 兩組小鼠不同時間點腫瘤細胞接種數及肝癌復發情況

2.3 兩組小鼠不同時間點血清中HBsAg表達：實驗組小鼠不同時間點血清HBsAg均為陽性，而對照組小鼠不同時間點均為陰性。

2.4 兩組小鼠不同時間點肝組織病理學改變（圖1）：對照組（1a）和實驗組（1b）小鼠術后1周肝組織HE染色偶見灶狀的腫瘤組織，其余肝小葉結構正常；對照組與實驗組小鼠術后2周肝組織HE染色（1c、1d）均可見肝組織內片狀的腫瘤病灶，可見核分裂象；術后3周對照組與實驗組（1e、1f）肝組織可見現彌漫性腫瘤病變，正常肝組織受壓，肝小葉結構消失，核分裂象明顯。術后1、2、3周兩組病理學改變未見明顯不同。

圖1 光鏡下觀察兩組小鼠不同時間點肝組織病理學改變 對照組小鼠術后1周（a）和實驗組術后1周（b）肝組織偶見灶狀的腫瘤組織，其余肝小葉結構正常；對照組術后2周（c）和實驗組術后2周（d）肝組織均可見片狀的腫瘤病灶；對照組術后3周（e）和實驗組術后3周（f）可見彌漫性腫瘤病變，肝組織受壓，肝小葉結構消失，核分裂現象明顯 HE 高倍放大

2.5 兩組小鼠不同時間點肝組織中PCNA、VEGF及ICAM-1的表達情況（表3；圖2～4）

2.5.1 光鏡下兩組小鼠不同時間點PCNA的表達（圖2）：術后1周對照組（2a）和實驗組（2b）均可見到腫瘤細胞核少量表達，其陽性率分別為22.80%±5.51%、22.20%±5.85%；術后2周對照組（2c）和實驗組（2d）均可見到腫瘤細胞核陽性表達增強，其陽性率分別為43.60%±6.95%、44.20%±6.07%；術后3周對照組（2e）和實驗組（2f）均可見腫瘤細胞廣泛表達，其陽性率分別為56.80%±9.14%、53.40%±7.92%。實驗組與對照組之間術后1、2、3周PCNA的陽性指數（P值分別為 0.81、0.84、0.39）和 HIS（P 值分別為 0.40、0.62、0.50）比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

圖2 光鏡下觀察兩組小鼠不同時間點肝組織PCNA的表達 術后1周：對照組（a）和實驗組（b）均可見腫瘤細胞核少量表達；術后2周：對照組（c）和實驗組（d）可見腫瘤細胞核表達均增強；術后3周：對照組（e）和實驗組（f）均可見腫瘤細胞廣泛表達 免疫組化 高倍放大

表3 兩組小鼠不同時間點PCNA、VEGF及ICAM-1表達情況比較

圖3 光鏡下觀察兩組小鼠不同時間點VEGF的表達術后1周：對照組（a）和實驗組（b）可見肝竇少量表達；術后2周：對照組（c）和實驗組（d），可見肝竇及腫瘤細胞間少量表達；術后3周：對照組（e）和實驗組（f）可見腫瘤細胞間表達明顯呈陽性免疫組化 高倍放大

2.5.2 光鏡下兩組小鼠不同時間點VEGF的表達（圖3）：術后1周對照組（3a）和實驗組（3b）可見肝竇少量表達，陽性率分別為17.00%±4.14%、20.80%±5.47%；術后2周對照組（3c）和實驗組（3d）可見肝竇及腫瘤細胞間少量表達，陽性率分別為26.70%±6.40%、25.90%±5.51%；術后3周對照組（3e）和實驗組（3f）可見腫瘤細胞間表達明顯呈陽性，其陽性率分別為37.30%±1.42%、37.60%±2.16%。實驗組與對照組之間術后1、2、3周VEGF的陽性指數（P值分別為0.09、0.77、0.91）和HIS（P值分別為1、0.64、0.84）比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

圖4 光鏡下觀察兩組小鼠不同時間點肝ICMA-1的表達 術后1周：對照組（a）和實驗組（b）可見肝組織間少量表達；術后2周：對照組（c）和實驗組（d）可見腫瘤組織少量表達，陽性率分別為22.80±2.97、23.20±3.61；術后3周：對照組（e）和實驗組（f）可見腫瘤細胞均較多表達，免疫組化 高倍放大

2.5.3 光鏡下兩組小鼠不同時間點ICAM-1的表達（圖4）：術后1周對照組（4a）和實驗組（4b）可見肝組織間少量表達，陽性率分別為14.50%±3.41%、15.40%±3.89%；術后2周對照組（4c）和實驗組（4d）可見腫瘤組織少量表達，陽性率分別為22.80%±2.97%、23.20%±3.61%；術后3周對照組（4e）和實驗組（4f）可見腫瘤細胞均較多表達，陽性率分別為29.40%±3.69%、31.30%±3.47%。實驗組與對照組之間術后1、2、3周ICAM-1的陽性指數（P值分別為0.59、0.79、0.25）和HIS（P值分別為0.79、0.77、0.74）比較差異均無統計學意義（均P＞0.05）。

3 討 論

本實驗通過建立小鼠肝癌復發模型，比較HBsAg陽性與HBsAg陰性小鼠在不同時間點的腫瘤復發情況。結果顯示，兩組小鼠在腫瘤復發率、腫瘤復發程度、肝組織病理學以及免疫組化（PCNA、VEGF及ICAM-1表達）方面均未見顯著性差異，由此表明在免疫抑制狀態下血清學HBsAg陽性對小鼠肝癌復發并無顯著影響。該實驗結果與目前研究認識不一致，因為HBV是導致肝癌形成的重要因素的觀點已被大量研究所證實［5-8］。綜合考慮，其原因可能為：① 乙肝病毒導致癌作用并不是在感染病毒之后很快就表現出來，而是經過一個長期的過程，或歷經肝臟纖維化后才導致腫瘤形成，HBV轉基因小鼠通常需要18月才會產生原發性肝癌。所以在肝癌肝移植術后早期HBsAg陽性供肝對腫瘤復發并未產生影響。② 肝癌肝移植術后腫瘤復發的機制主要是微轉移灶的形成，其對肝癌復發的作用可能要遠遠超過HBsAg陽性供肝的影響，從而可能掩蓋后者對腫瘤復發的作用。本實驗是通過脾包膜下接種腫瘤細胞，是從肝癌復發機制出發來建立的動物模型，存在較為明顯的微轉移灶，因此得出了免疫抑制狀態下血清學HBsAg陽性對小鼠肝癌復發并無明顯影響的結論。③ 由于時間、技術和費用的關系，本實驗動物模型并未完全符合臨床肝癌肝移植術后腫瘤復發的標準，有可能對實驗結果造成影響。

肝臟移植目前已成為治療各種終末期肝病和部分肝臟惡性腫瘤的最有效手段之一，但供體缺乏是制約肝移植發展的最主要瓶頸。邊緣供肝的使用是目前擴大供體來源的主要方式之一［9］。目前，國內外均有應用HBsAg陽性供肝行肝移植術的安全性報道。我們也嘗試應用HBsAg陽性供肝治療晚期肝癌患者，但術后患者均死于肝癌復發。因此HBsAg陽性供肝是否會促進肝癌患者腫瘤復發需要進一步驗證。本實驗結果證實HBsAg陽性在免疫抑制狀態下對肝癌復發無顯著影響。本實驗部分模擬HBsAg陽性供肝對肝移植術后腫瘤復發的動物模型，這對研究HBsAg陽性供肝對肝移植術后腫瘤復發的影響具有一定的指導意義。因此，筆者認為在HBV相關的肝癌患者中，可考慮應用HBsAg陽性供肝行肝移植術。該方法是安全有效的，一方面能夠使患者縮短等待供體時間，提高患者預后，另一方面能夠在一定程度上緩解供肝短缺的窘境，具有非常重要的意義。