內蒙古錫林郭勒地區酸馬奶中乳酸菌的分離鑒定

劉紅新，任艷，張冬蕾，楊彥榮，劉文俊，孫天松

（內蒙古農業大學乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，呼和浩特010018）

0 引言

酸馬奶（koumiss）是中亞地區傳統的發酵馬乳飲料,又稱“馬奶酒”[1]。它以新鮮馬奶為原料，經乳酸菌和酵母菌共同發酵而成，具有獨特的風味和豐富的營養價值[2]。蒙醫藥典中也曾記載酸馬奶能開胃、祛濕、解毒潤膚等功效[3]。酸馬奶之所以具有與馬奶不同的功效，主要由于其微生物菌群以酵母菌群和乳酸菌群為主。乳酸菌是指發酵碳水化合物產生乳酸的一類革蘭氏陽性、不產芽孢、過氧化氫酶陰性的一類細菌的總稱[4]，在人體內具有諸多益生作用[5]。

本研究采用實驗室純培養的方法分離、鑒定錫林郭勒地區傳統酸馬奶中的乳酸菌，通過16S rDNA序列分析的方法對乳酸菌分離株進行鑒定，并分析其優勢菌群，保護我國益生菌資源，為傳統酸馬奶的篩選和開發利用提供參考。

1 實驗

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

本研究中27份酸馬奶樣品由實驗室的研究人員于2014年7月16日—2014年7月18日在內蒙古錫林郭勒的不同地區采集。樣品采集后低溫保存，帶回實驗室于-80℃超低溫保藏，進行后續實驗。

1.1.2 培養基與試劑

培養基：MRS固體培養基，MRS液體培養基，M17固體培養基，M17液體培養基。

實驗所用試劑：PBS保護液，PBS緩沖液，脫脂乳保護劑，提取DNA所用試劑，PCR擴增和電泳檢測所用試劑[6]。

1.1.3 儀器與設備

便攜式冰箱，溫度計，便攜式PH計，采樣箱等。

ZHJH-C1214C型超凈工作臺，TGL-168高速臺式離心機，HWS28型電熱恒溫水浴鍋，AR2202CN型電子天平，KDC-1044型低速離心機，LRH-250生化培養箱，BX50型光學顯微鏡，HA-300M型全自動高壓蒸汽滅菌器，SP-650型全自動高壓干熱滅菌器，WD-9405B型水平搖床，LL-6SFPY型真空冷凍干燥機，PTC-200梯度基因擴增儀；DYY-12型電泳儀，GDS-8000型凝膠成像儀，ND-1000型微量紫外分光光度計等。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集

本試驗在采集乳樣品時采用直接取樣法。先將容器中的發酵乳制品充分混勻，再用移液槍吸取1.5 mL樣品至裝有滅菌中和劑（內含0.5 g,CaCO3：淀粉=1∶50，質量比）的2.5 mL無菌螺口凍存管中，混勻后標記樣品號并作記錄，封口保存。最后將采集的乳樣置于4℃便攜式冰箱中以維持其低溫狀態，盡快帶回實驗室進行乳酸菌的分離純化等實驗。

1.2.2 樣品中乳酸菌的計數

乳酸菌計數根據參考文獻[7]采用傾注培養法。計數即為每mL樣品的菌落數。

1.2.3 樣品中乳酸菌的分離純化及保存

分別吸取 0.2 mL稀釋度為10-5，10-6，10-7稀釋液于MRS固體培養基上涂布后置于37℃恒溫培養箱中厭氧培養48 h，待菌落形成后，隨機挑取形態學特征各不相同的單個菌落于相應的液體培養基中，37℃培養24 h。將不純的菌株在MRS固體培養基上劃線分離，37℃培養48 h，如此反復2～3次，直至鏡檢結果為純的單菌后編號并接種于相應液體培養基進行擴培和傳代。

選取過氧化氫陰性、革蘭氏陽性的純培養物，將此培養物暫定為乳酸菌，加入質量分數為0.1%谷氨酸鈉的脫脂乳保護劑，混勻后置于-80℃保存備用。同時，另一份樣品進行DNA提取和后續鑒定實驗。

1.3 16S rDNA序列分析

1.3.1 總DNA的提取及純度的檢測

采用液氮反復凍融-CTAB法提取乳酸菌基因組DNA[8]。再用ND-1000型微量紫外分光光度計測其濃度以及OD260/280值。再用質量分數為1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2 16S rRNA基因的PCR擴增

16S rRNA基因的PCR擴增引物序列為

FA-27F：5'-GCAGAGTTCTCGGAGTCACGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，

RA-1495R：5'-AGCGGATCACTTCACACAGGACTACGGCTACCTTGTTACGA-3'[9]。

PCR擴增體系（模板為上述DNA稀釋液）：5 μL10×EasyTaq Buffer（+Mg2+）；4 μL High Pure dNTPs（2.5 mmol/L）；1.5 μL 引物 FA-27F（濃度 10 mmol/L）；1.5 μL 引 物 RA-1495R（10 mmol/L）；0.5 μL EasyTaq DNA polymerase（5 U/μL）；2 μL DNA 模板（質量濃度100 ng/μL）；35.5 μL ddH2O。

PCR擴增循環參數為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；72℃末端延伸10 min。

擴增完畢后，取約2 μL的PCR擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，若在1 500 bp處有清晰的擴增條帶且無拖尾、彌散現象，則PCR擴增成功[10]。將PCR擴增產物送往上海美吉生物公司進行純化和DNA測序。

1.4 同源性分析

將測序得到的DNA序列運用SeqMan（DNAStar 5.01）軟件進行序列拼接后，再利用NCBI中的BLAST將拼接好的序列與數據庫中已鑒定的乳酸菌16S rDNA序列進行同源性分析，將待鑒定菌株序列與同源性最高的模式菌株序列應用MEGA 4.0（http：//www.megasoftware.net）軟件構建系統發育樹，進行遺傳進化研究。

2 結果與分析

2.1 乳酸菌分離株的菌落形態及細胞形態特征

根據乳酸菌的形態學特征[11-12]，初步從27個酸馬奶樣品中共分離出83株疑似乳酸菌的菌株。經過革蘭氏染色、過氧化氫酶反應，均為革蘭氏陽性，過氧化氫陰性菌[13]。初步將83株菌定為乳酸菌。

2.2 乳酸菌計數結果

錫林郭勒地區酸馬奶中乳酸菌的活菌數如表1所示。

由表1可以看出，酸馬奶樣品中乳酸菌數在4.44～8.99 mL-1（對數值）之間。平均值為（6.09±0.13）mL-1（對數值）。其中XM3，XM4，XM14等樣品中乳酸菌活菌數低于106/mL-1，低于酸奶國家標準。大部分菌株的活菌數高于106mL-1，符合新的酸奶國家標準和國家衛生標準，有利于進一步分離與研究。由于本次采樣，并未按照特定時間點進行，是隨機采樣，有的地點樣品發酵和貯藏時間長，有的樣品發酵和貯藏時間短，所以其中乳酸菌活菌數量存在較大差異。李道敏,劉開永等人[14]對木糖醇酸奶發酵、貯藏期間質量變化做過研究，閆志國[15]對發酵乳在貯藏期間的理化性質的變化也做過詳細報道，均闡述自然發酵乳制品中微生物隨著發酵和貯藏時間的延長，乳酸菌種屬和數量有較大的變化。

表1 內蒙古錫林郭勒地區酸馬奶中乳酸菌計數結果 mL-1

2.3 乳酸菌分離鑒定結果

2.3.1 DNA提取和PCR擴增結果

DNA濃度和OD260/280值的測定：提取83株乳酸菌的DNA并測其濃度以及OD260/280值，OD260/280值在1.8～2.0之間即為純DNA樣品。將DNA原液稀釋至濃度為100 ng/μL后進行16S rRNA基因的PCR擴增。擴增結果經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，可以觀察到在大約1 500 bp的位置處有一條清晰明亮的條帶，并且無拖尾、彌散現象，未發現明顯非特異擴增現象，說明分析菌株的16S rRNA基因擴增成功。將PCR擴增產物送于上海美吉生物科技有限公司進行測序。

圖1 部分分離菌DNA瓊脂糖凝膠電泳

2.3.2 16S rRNA基因同源性比對及系統發育樹構建

將測序獲得的16S rRNA基因序列通過NCBI數據庫中BLAST進行同源序列比對分析,若同源性高于99%則可直接將其歸為此種模式株菌種，選取部分具有代表性的菌株用 MEGA 4.0（http：//www.megasoftware.net）軟件構建系統發育樹。分離株與模式株系統發育樹見圖2（選取部分作圖）：

圖2 內蒙古錫林郭勒地區代表性分離株的16S rRNA基因序列的系統發育樹

由圖2可以看出，所有分離株聚為2個大的類群，一個類群為桿菌，一個類群為球菌，IMAU11650（KR858843）與模式菌Enterococcus durans ATCC19432（AJ276354）聚為一類，同源性分別為100%，將其鑒定為 Enterococcus durans。IMAU11655（KR858848）與模式菌Enterococcus faecium ATCC19434（AJ301830）聚為一類，同源性為100%，因此將歸其為Enterococcus faecium。IMAU11642（KR858836）與模式菌Enterococcus devriesei CCM7299（AJ891167）聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Enterococcus devriesei。IMAU11152（KR858806）與模式菌Enterococcus faecalis JCM5803（AB012212）聚為一類，同源性為100%，故鑒定為Enterococcus faecalis。IMAU11668（KR858860）與模式菌Enterococcus italicus DSM 15952（AJ582753）聚為一類，同源性為 100%，故將其鑒定為Enterococcusitalicus。IMAU11124（KR858778）與模式菌Lactococcus lactis subsp.lactis ATCC19435（AB100803）聚為一類，同源性為100%,故鑒定為Lactococcus lactis subsp.Lactis。IMAU11138（KR858792）與模式菌Streptococcus parauberis DSM6631（AY584477）聚為一類，同源性為99%，故將其歸為為Streptococcus parauberis。IMAU11641（KR858835）與模式菌Lactobacillus plantarum ATCC14917（AJ965482）聚為一類，同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillus plantarum。IMAU11674（KR858866）與模式菌Lactobacillus diolivorans DSM14421（AF264701）聚為一類，同源性為100%，故將其鑒定為Lactobacillusdiolivorans。IMAU11656（KR858849）與Lactobacillus casei ATCC393（AF469172）聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Lactobacillus casei。 IMAU11657（KR858850）與模式菌Lactobacillus paracasei ATCC25302（D79212）聚為一類，同源性為100%，因此將其鑒定為Lactobacillus paracasei。IMAU11644（KR858838）與模式菌Lactobacillus helveticus ATCC15009（AM113779）聚為一類，同源性分別為99%，故鑒定為 Lactobacillus helveticus。IMAU11126（KR858780）與模式菌 Lactobacillus kefiranofaciensDSM 5016（AM113781）聚為一類，同源性為99%故，將其鑒定為Lactobacillus kefiranofaciens。IMAU11158（KR858812）與模式菌 Leuconostoc pseudomesenteroides ATCC12291（AB023237）聚為一類，同源性分別為99%，故鑒定為Leuconostoc pseudomesenteroides。IMAU 11125（KR858779）與模式菌Leuconostoc mesenteroides NCFB529（AB023244）聚為一類，同源性為99%，故將其鑒定為Leuconostoc mesenteroides。根據16S rDNA序列分析，分離的83株菌中，49株菌與模式菌株的同源性達到99%，34株菌與模式菌株的同源性達到100%。

2.4 錫林郭勒地區酸馬奶中乳酸菌的優勢菌種分析

乳酸菌的分布結果如表2所示。

表2 內蒙古錫林郭勒地區酸馬奶中乳酸菌的分離結果

由表2可以看出，27份酸馬奶樣品中分離出的83株乳酸菌疑似菌株，經16S rDNA序列測定和同源性分析鑒定，分屬于5個屬15個種或亞種。其中錫林郭勒地區的優勢菌群為Lactococcus lactis subsp.lactis，占總分離株的34%。近幾年，孫天松[16]等人對新疆地區酸馬奶進行分離鑒定，其優勢菌種為Lactobacillus helveticus。劉芳、都立輝[17]等人對內蒙古酸馬奶多樣性進行研究，發現Lactococcus lactis為優勢菌群。魏艷、曾小群[18]等人對新疆酸馬奶中乳酸菌分離鑒定，結果表明優勢菌群為發酵乳桿菌和干酪乳桿菌。由此可見不同地區酸馬奶優勢菌種不同，即使同一地區采樣時間、貯藏時間不同，結果也會有差異。

3 結論

本研究對27份錫林郭勒地區酸馬奶樣品進行乳酸菌的分離鑒定，共分離出83株乳酸菌。通過16S rDNA序列同源性分析，將83株乳酸菌鑒定為5個屬，15個種或亞種，分別屬于乳桿菌屬、乳球菌屬、明串珠菌屬、腸球菌屬、鏈球菌屬。其中Lactococcus lactis subsp.Lactis為錫林郭勒地區酸馬奶中的優勢菌種，占總分離株的34%。

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