鐵皮石斛組培體藥用和營養成分含量的比較

張本厚　胡燕花　金磊磊　陳集雙

摘要：為了探明鐵皮石斛組培體中藥用和營養成分含量，比較研究3種鐵皮石斛組培體和人工栽培鐵皮石斛干物率、多糖含量、總生物堿含量和總蛋白質含量。結果表明：三年生人工栽培鐵皮石斛莖段干物率為20.79%，顯著高于3種鐵皮石斛組培體，原球莖干物率為3.77%，顯著低于2種組培苗；三年生人工栽培鐵皮石斛莖段多糖和總生物堿含量分別為24.66%和0.027%，均顯著高于3種鐵皮石斛組培體，原球莖多糖和總生物堿含量分別為11.53%和0018%，均顯著高于2種組培苗；3種鐵皮石斛組培體總蛋白含量均顯著高于三年生人工栽培鐵皮石斛莖段（687%），原球莖總蛋白含量為22.19%，顯著高于2種組培苗。綜合而言，雖然鐵皮石斛原球莖水分含量較高，但其增殖速率遠大于人工栽培鐵皮石斛和組培苗；在藥用和營養成分方面，雖然鐵皮石斛原球莖的多糖和總生物堿含量低于人工栽培鐵皮石斛，但其多糖、總生物堿和總蛋白含量均高于2種組培苗。因此，鐵皮石斛原球莖具有很好的開發應用前景。

關鍵詞：鐵皮石斛；組培體；藥用成分；營養成分；多糖；總生物堿；總蛋白

中圖分類號： S567.23+9.01 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）10-0324-04

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium）多年生草本植物，始載于《神農本草經》，為我國傳統的名貴中藥材，被譽為“中華九大仙草之首”?！吨袊幍洹罚?010年版）記載，鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱等功效?，F代藥理研究表明，鐵皮石斛具有增強免疫力[1-3]、降血壓[4]、降血糖[5]、抗腫瘤[6-8]、抗氧化[9-11]等作用。由于鐵皮石斛種子極小、無胚乳、自然條件下須與真菌共生才能萌發，萌發率低，自然情況下多采用無性繁殖方式進行增殖，增殖率較低，加之鐵皮石斛野生資源過度采挖以及所依賴環境的破壞，野生鐵皮石斛資源已經瀕臨滅絕[12]，成為“瀕危珍稀植物”，被列入《國家重點保護野生藥材物種名錄》和《中國植物紅皮書》[13-14]，已無法滿足市場需求。為保護和持續利用這一珍稀中藥品種，植物組織培養和人工栽培技術已廣泛用于鐵皮石斛生產。目前，鐵皮石斛藥源以人工栽培的鐵皮石斛為主，但供需缺口仍相當懸殊，主要是由于鐵皮石斛人工栽培存在成活率低、生產周期長、成本高、植株生長不一等問題。近年來，不少研究表明，鐵皮石斛組培體與原藥材藥效相似[15-16]，其是否可以成為鐵皮石斛替代性藥源，從中提取有效成分，引起人們的廣泛關注。本研究以3種鐵皮石斛組培體與人工栽培鐵皮石斛為材料，比較其干物率、2種藥用成分（多糖和總生物堿含量）和1種營養成分（總蛋白含量），為鐵皮石斛組培體的開發應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為4種鐵皮石斛人工培養體：固體培養30 d的鐵皮石斛原球莖、固體繼代培養60 d的3 cm鐵皮石斛組培小苗、固體繼代培養120 d的7 cm鐵皮石斛組培大苗、三年生人工栽培鐵皮石斛莖段。本試驗所有供試材料均來自同一株鐵皮石斛，其中原球莖和組培苗是將該植株成熟種子通過植物組織培養獲得的，三年生人工栽培鐵皮石斛莖段是將該植株置于自然環境中人工栽培3年獲得的。

1.2 試驗方法

1.2.1 干物率的測定 稱取100 g左右的鐵皮石斛新鮮樣品（m1），104 ℃ 20 min殺青，80 ℃烘干至恒質量，準確稱取鐵皮石斛樣品干質量（m2）。

干物率=m2/m1×100%。

1.2.2 多糖含量的測定

1.2.2.1 標準曲線的制作 準確稱取10.00 mg經80 ℃烘干至恒質量的蔗糖標準品，置于100 mL的容量瓶中，加蒸餾水稀釋至刻度，充分混勻。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于試管中，加蒸餾水至2 mL，同時以2 mL蒸餾水為空白對照。依次加入0.5 mL蒽酮溶液（1.00 g蒽酮溶于50 mL乙酸乙酯）和5 mL濃硫酸，充分混勻，置于沸水浴中加熱10 min，取出冷卻至室溫，于620 nm處測得吸光度。

1.2.2.2 樣品多糖含量的測定 將鐵皮石斛新鮮樣品于104 ℃下殺青20 min，80 ℃烘干至恒質量，研成粉末，精確稱取0.10 g鐵皮石斛樣品粉末置于三角瓶中，加入20 mL 80%乙醇，超聲提取2次，3 500 r/min離心5 min后棄上清（以去除單糖、低聚糖及苷類等干擾性成分），將殘渣用蒸餾水清洗2次，加入6 mL蒸餾水，沸水浴提取30 min，提取液經2層濾紙過濾，收集濾液，殘渣重復提取2次，合并2次濾液并加蒸餾水至200 mL。取1 mL置于試管中，加蒸餾水至3 mL，充分混勻，作為樣品液（稀釋3倍）。取2 mL樣品液，同時以2 mL蒸餾水作為空白對照，按照標準曲線的操作方法于620 nm處測吸光度。

1.2.3 總生物堿含量的測定 總生物堿含量的測定方法參照金蓉鸞等的方法[17-18]。（1）標準曲線的制作。精確稱取1.00 mg 石斛堿標準品置于100 mL容量瓶中，加三氯甲烷至刻度線。分別取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于分液漏斗中，加三氯甲烷至10 mL，同時以10 mL三氯甲烷為空白對照，加入pH值為4.5的緩沖液5 mL和0.04%溴甲酚綠溶液2 mL，劇烈振搖3 min，靜置30 min。三氯甲烷層通過經三氯甲烷浸泡處理并干燥后的藥棉濾過，取5 mL三氯甲烷續濾液，加001 mol/L NaOH-無水乙醇溶液l mL，充分混勻，于620 nm處測吸光度。（2）樣品總生物堿含量的測定。將鐵皮石斛新鮮樣品烘干，精確稱取0.50 g樣品粉末（過60目篩）置于 25 mL 三角瓶中，加入3～5 mL濃氨水充分潤濕后，密閉放置30 min，加入10 mL三氯甲烷，稱質量，置于水浴鍋中加熱回流提取2 h，冷卻后稱質量，補充三氯甲烷至原質量，過濾。取2 mL置于10 mL容量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，充分混勻，作為樣品液（稀釋5倍）。endprint

取10 mL樣品液，同時取10 mL三氯甲烷作為空白對照，按照標準曲線的操作方法，于620 nm處測得吸光度。同時取石斛堿標準溶液（25 μg/mL）2 mL置于25 mL容量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，充分混勻，取10 mL（含20 μg石斛堿）置于分液漏斗中，按照標準曲線的操作方法，于620 nm處測得吸光度，則

總生物堿含量=D樣品液×20 μg×n÷D標準品溶液÷m。

式中：D樣品液代表樣品液吸光度；D標準溶液代表石斛堿標準溶液吸光度；n代表稀釋倍數；m代表樣品質量。

1.2.4 總蛋白含量的測定 將鐵皮石斛新鮮樣品烘干，精確稱取0.10 g置于研缽中，加入0.02 g石英砂和2 mL 30% NaOH溶液，研磨2 min后再加入10 mL 60%堿性乙醇，研磨5 min；然后用60%堿性乙醇將研磨好的樣品無損地洗入50 mL 容量瓶中，60%堿性乙醇定容至刻度，搖勻后靜置片刻，取部分浸提液3 500 r/min離心10 min。吸取上清液1 mL于50 mL容量瓶中，用60%堿性乙醇定容至刻度，作為樣品液。利用分光光度法，于280、260 nm波長下分別測定吸收度，則

總蛋白含量=（1.45×D280 nm-0.74×D260 nm）÷V÷1 000÷m×100%。

式中：D280 nm代表蛋白質提取液在280 nm處測得的吸光度；D260 nm代表蛋白質提取液在260 nm處測得的吸光度；V代表將所有樣品提取液稀釋成測量液濃度后的總體積，mL；m代表樣品質量，g。

1.2.5 數據處理 運用SPSS 17.0中的單因素方差分析（One-way ANOVA）比較4種不同鐵皮石斛培養體之間的干物率、多糖含量、總蛋白質含量和總生物堿含量的差異性。

2 結果與分析

2.1 干物率的比較

4種鐵皮石斛培養體鮮品和干品形態對比結果如圖1所示。4種鐵皮石斛培養體干物率比較結果如表1所示，隨著培養時間的增加，干物率呈遞增趨勢，三年生人工栽培鐵皮石斛莖段干物率最高，為20.79%，顯著高于其他3種鐵皮石斛組培體。3種鐵皮石斛組培體中，原球莖干物率為3.77%，顯著低于2種組培苗。3 cm組培小苗和7 cm組培大苗干物率分別為6.21%和7.82%，且7 cm組培大苗干物率顯著高于3 cm 組培小苗。

2.2 多糖含量的比較

以蔗糖濃度（C1，μg/mL）為橫坐標，吸光度（D1）為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為D1=0.011 4C1-0.000 5，r2=0.999 3。

4種鐵皮石斛培養體多糖含量比較結果如圖2所示，三年生人工栽培鐵皮石斛莖段多糖含量最高，為24.66%，顯著高于其他3種鐵皮石斛組培體。3種鐵皮石斛組培體中，原球莖多糖含量為11.53%，顯著高于2種組培苗。3 cm組培小苗和7 cm組培大苗多糖含量分別為5.76%和6.71%，兩者之間沒有顯著差異。

2.3 總生物堿含量的比較

以石斛堿濃度（C2，μg/mL）為橫坐標，吸光度（D2）為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為：D2=0.075 5C2+0.000 7，r2=0.999 0。

4種鐵皮石斛培養體總生物堿含量比較結果如圖3所示，三年生人工栽培鐵皮石斛莖段總生物堿含量最高，為0.027%，顯著高于其他3種鐵皮石斛組培體。3種鐵皮石斛組培體中，原球莖總生物堿含量為0.018%，顯著高于2種組培苗。3 cm組培小苗和7 cm組培大苗總生物堿含量分別為0.013%和0.012%，兩者之間沒有顯著差異。

2.4 總蛋白含量的比較

4種鐵皮石斛培養體總蛋白含量比較結果如圖4所示，隨著培養時間的延長，總蛋白含量呈遞減趨勢，三年生人工栽培鐵皮石斛莖段總蛋白含量為6.87%，顯著低于其他3種鐵皮石斛組培體。3種鐵皮石斛組培體中，原球莖總蛋白含量為22.19%，顯著高于2種組培苗。3 cm組培小苗和 7 cm 組培大苗總蛋白含量分別為18.82%和16.14%，且3 cm組培小苗總蛋白含量顯著高于7cm組培大苗。

3 結論與討論

鐵皮石斛組織培養物是否可以作為鐵皮石斛替代性藥源，并從中提取有效成分，主要取決于其有效成分的含量和藥理作用。目前，已有眾多研究表明鐵皮石斛組培體與原藥材具有相似的藥理作用[6，15-16，19-24]。多糖為鐵皮石斛最主要的有效成分，因此鐵皮石斛組培體中多糖含量成為評定組培體質量的重要因素。許多研究結果顯示，鐵皮石斛組培體多糖含量低于鐵皮石斛楓斗、人工栽培或野生鐵皮石斛[19，25-28]，這與本試驗結果一致，但也有研究報道鐵皮石斛組培體多糖含量與人工栽培或野生鐵皮石斛相當甚至更高[16，29-30]。本試驗結果顯示，3種鐵皮石斛組培體中原球莖多糖含量顯著高于2種組培苗，與大多數前人的研究結論[19，27，29，31]一致，也有少數研究結果顯示鐵皮石斛組培苗多糖含量高于原球莖或擬原球莖[25，32]。

生物堿是鐵皮石斛重要的有效成分之一，鐵皮石斛組培體中生物堿含量也會影響組培體的品質。辛甜等的研究結果顯示，鐵皮石斛組培體的生物堿含量低于鐵皮石斛楓斗、栽培植株和野生植株[19，33]，這與本試驗結果一致；但是孫丹的研究結果顯示，鐵皮石斛原球莖生物堿含量高于一年生栽培植株[29]。本試驗結果顯示，3種鐵皮石斛組培體中原球莖總生物堿含量顯著高于2種組培苗，與大多數前人的研究結論[19，29]一致，但是李瑩的研究結果顯示鐵皮石斛原球莖的生物堿含量略低于組培苗[32]。

鐵皮石斛作為一種藥食同源的中藥材，除了藥用價值外，其營養價值也不容忽視。蛋白質是一種重要的營養成分，可以滿足人們對蛋白質和氨基酸的需求。目前鐵皮石斛組培體雖不可直接入藥或食用，但在有效成分提取過程中，蛋白質可以作為營養保健品加以提取利用，因此鐵皮石斛組培體的蛋白質含量和氨基酸組成對其蛋白質的利用具有重要的意義。目前，已有不少學者對鐵皮石斛組培體與鐵皮石斛楓斗、栽培植株或野生植株的蛋白質或總氨基酸含量進行研究，結果顯示隨著培養時間的延長，蛋白質或總氨基酸的含量呈遞減趨勢[25，28，30，34]，這與本試驗結果一致，這可能與隨著培養時間的延長，鐵皮石斛組培體或栽培植株的纖維化程度逐漸加深、生長活躍程度逐漸降低有關。關于鐵皮石斛蛋白質氨基酸的組成本試驗未著重分析研究，有待后續試驗進一步研究。目前已有不少研究對鐵皮石斛組培體蛋白質的氨基酸組成進行分析，大部分研究結果顯示組培體蛋白質的氨基酸組成與鐵皮石斛楓斗的栽培植株或野生植株一致[19，28，34]。endprint

本研究結果表明，隨著培養時間的延長，鐵皮石斛組培體或栽培植株的干物率逐漸增加，其水分含量逐漸降低，這可能與其纖維化程度逐漸加深有關。

綜上所述，3種鐵皮石斛組培體中，原球莖的多糖、總生物堿和總蛋白含量均最高，雖然其多糖和總生物堿含量低于三年生人工栽培鐵皮石斛莖段，水分含量較高，但是其增殖速率快、生長周期短、產量高；生產條件可控、產品質量均一，便于標準化生產；生產方式簡便、生產成本低等優勢，將鐵皮石斛原球莖作為鐵皮石斛替代性藥源，從中提取藥用和營養成分，用于醫藥、保健品、護膚品等行業，具有很好的開發應用前景，同時也緩解了鐵皮石斛野生資源枯竭、藥源緊缺等問題，對于保護鐵皮石斛野生資源、實現其可持續利用具有重要意義。

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