磷酸化ERK1/2對帕金森病模型小鼠黑質半胱氨酸蛋白酶-3表達的影響

石　沖　張國彬　張宇新　張作鳳

(唐山市婦幼保健院遺傳生殖科，河北　唐山　063000)

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磷酸化ERK1/2對帕金森病模型小鼠黑質半胱氨酸蛋白酶-3表達的影響

石沖張國彬1張宇新1張作鳳1

(唐山市婦幼保健院遺傳生殖科，河北唐山063000)

摘要〔〕目的研究磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)對1-甲基-4-苯基-1，2，3，6四氫吡啶(MPTP)所致帕金森病(PD)模型小鼠黑質中半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3的調控作用。方法建立PD小鼠模型，觀察小鼠行為學變化；免疫組化和免疫印跡法檢測黑質酪氨酸羥化酶(TH)、caspase-3和p-ERK1/2的陽性細胞數和蛋白表達水平以及caspase-3酶活性改變，并觀察給予p-ERK1/2特異性抑制劑U0126對上述變化的影響。結果與對照組相比，模型小鼠出現典型PD癥狀,TH蛋白水平下降約28.2%(P=0.009)，p-ERK1/2、caspase-3陽性細胞及蛋白水平顯著增加(P<0.01)；經ERK1/2抑制劑U0126處理后，上述變化均顯著減輕(P<0.01)。結論P-ERK1/2對MPTP誘導的PD小鼠黑質caspase-3表達可能有調控作用，U0126對PD小鼠具有一定的神經保護作用。

關鍵詞〔〕帕金森??；MPTP；磷酸化ERK1/2；半胱氨酸蛋白酶-3；U0126

1河北聯合大學研究生學院

第一作者：石沖(1981-)，女，主治醫師，博士，主要從事神經退行性疾病發病機制研究。

帕金森病(PD)的病理特征為中腦黑質多巴胺(DA)能神經元進行性變性丟失，具體發病機制尚未明確〔1〕。研究表明PD病人和模型動物黑質區可見caspase-3激活介導的細胞凋亡〔2，3〕，PD小鼠敲除caspase-3基因明顯減少黑質區DA能神經元丟失〔4〕，提示caspase-3在PD發病過程中可能起重要作用。闡述caspase-3的表達調控，利于揭示PD的發病機制。研究表明p-ERK1/2調控caspase-3激活〔5,6〕，類似機制是否存在于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氫吡啶(MPTP)誘導PD模型小鼠DA能神經元丟失進程還不清楚。本實驗觀察PD小鼠模型中p-ERK1/2對中腦黑質區caspase-3表達和活性的影響，為PD的機制研究提供新思路。

1材料和方法

1.1動物采用北京維通利華公司實驗動物中心C57BL/6N雄性小鼠30只，8～12周齡，25～30 g。自然光照，室溫(25±2)℃，小鼠自由進食飲水，適應環境1 w后進行實驗，所有動物操作均符合動物倫理委員會的有關規定。

1.2試劑MPTP(美國Sigma公司)，兔抗人caspase-3 mAb(福州邁新生物)，小鼠抗人TH mAb(美國Chemicon公司)，鼠抗人p-ERK mAb(美國Santa cruz公司)，p-ERK抑制劑U0126(德國Merk公司)，caspase-3熒光底物Ac-DEVD-AMC(美國Chemicon公司)，兔/鼠SP超敏試劑盒(福州邁新生物)。

1.3儀器設備組織切片機(Leitz 1512型，德國Leitz公司)，OLYMPUS光學顯微鏡(日本Olympus公司)，電子天平(JA-2003型，上海天平儀器廠)，低溫離心機(TGL-16G-A型，上海安亭科學儀器廠)，圖像分析系統(CMIAS，北京航空航天大學)，電泳儀(DYY-TB型，北京六一儀器廠)，半干式碳板轉移電泳槽(DYY-Ⅲ40C型，北京六一儀器廠)。

1.4實驗方法〔7〕

1.4.1動物分組小鼠隨機分成三組，每組10次，模型組：0.3%MPTP(30 mg/kg)生理鹽水配制并腹腔注射，1次/d。U0126組：MPTP注射前3 d腹腔預注射U0126(5 mg/kg,ip)，1次/d，連續3 d，每天注射MPTP前2～3 h注射1次U0126。對照組：注射與模型組等體積的生理鹽水。注射藥物后觀察小鼠行為變化。各組均于第5次MPTP注射后6 h取腦。

1.4.2免疫組化MPTP第5次注射后6 h麻醉小鼠，經固定后每只小鼠取中腦3個相同斷面行免疫組化染色。切片脫蠟后水浴法熱修復，然后30 ml/L過氧化氫阻斷內源過氧化物酶，非免疫動物血清室溫孵育10 min。分別加入鼠抗人p-ERK1/2 mAb(1∶100)，兔抗人caspase-3 mAb(1∶100)4℃過夜。二抗室溫孵育30 min，最后DAB顯色并拍照分析。

1.4.3免疫印跡麻醉小鼠迅速斷頭取腦并分離中腦黑質，低溫勻漿后靜置30 min，高速離心后取上清備用。蛋白定量并在95℃水浴變性5 min。樣品凝膠電泳結束后轉膜，加入TH 單抗(1∶1 000)、caspase-3單抗(1∶400)和p-ERK1/2 單抗(1∶300)4℃過夜?？寡?1∶200)室溫孵育2 h，化學發光并曝光，掃描結果使用Image J軟件。

1.4.4caspase-3酶活性測定模型制作成功后裂解組織提取蛋白并測蛋白濃度,調節蛋白濃度為1 μg/μl。100 μl體系中加入caspase-3特異性熒光底物Ac-DEVD-AMC，37℃避光孵育1 h。酶標儀檢測熒光強度，激發光波長360 nm，發射光波長為460 nm。重復3孔并記錄結果。

1.5圖像分析免疫組化切片在CMIAS真彩色醫學圖像分析系統10×物鏡下定位，計數陽性細胞數，每張腦片6個部位并計算均值。Image J軟件分析平均光密度值以比較各組Western印跡蛋白的表達。

2結果

2.1行為學觀察30只小鼠無死亡，均納入結果分析。模型組小鼠MPTP注射后約20 min出現豎毛、尾過伸上翹、陣發性軀干震顫、易激惹、小便失禁、步態蹣跚等短暫的行為反應，隨后出現自發性活動明顯減少，次日略見恢復；U0126組小鼠與模型組相比PD特異性癥狀有所減輕。對照組小鼠活動一切如常。

2.2黑質區caspase-3及p-ERK免疫組化結果對照組偶見caspase-3陽性細胞，胞質著色淺；MPTP5次注射后6 h，caspase-3陽性細胞胞質著色很深。與模型組相比，U0126組陽性細胞數量明顯減少，且胞質著色略變淺(P<0.01)。對照組僅見少量p-ERK胞質淺著色細胞；模型組6 h胞質、胞核均呈黃褐色p-ERK少量陽性細胞；與模型組相比，U0126組僅見細胞核染黃褐色，胞質著色略淺(P<0.01)。見圖1，表1。

圖1　中腦黑質區p-ERK1/2,caspase-3免疫組化染色(×200)

組別p-ERK1/2caspase-3對照組14.50±2.0710.83±2.64模型組54.33±3.931)45.67±1.511)U0126組29.50±1.872)32.50±2.432)

與對照組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05，下表同

2.3Western印跡檢測TH、caspase-3、p-ERK1/2蛋白結果分子量約Marker 61 000處,可見TH特異性蛋白條帶。與對照組相比，MPTP模型組TH蛋白表達明顯降約28.2%(P=0.009)。分子量約33 000處可見caspase-3特異性蛋白條帶，模型組蛋白條帶著色最深，U0126組同時間點與模型組相比條帶較窄，染色較淺。經圖像分析，差異有統計學意義(P<0.01)。對照組在約44 000和42 000分子量處可見p-ERK1/2特異性窄淺清晰蛋白條帶，模型組蛋白條帶著色略深，U0126組與模型組相比蛋白條帶略淺。差異顯著(P=0.002)，見圖2，表2。

圖2　中腦黑質區磷酸化p-ERK1/2、caspase-3 Western印跡結果

組別p-ERK1/2caspase-3TH對照組0.77±0.01540.61±0.0030.53±0.009模型組0.99±0.0031)0.99±0.0081)0.41±0.0111)U0126組0.84±0.0062)0.74±0.0072)0.47±0.0052)

2.4caspase-3酶活性結果模型組MPTP誘導的caspase-3酶活性極大增強(0.004 pmd/min)，使用p-ERK1/2上游激酶特異性抑制劑U0126后caspase-3活性有所抑制(0.003 pmol/min，P<0.05)。

3討論

PD發病的臨床表現有靜止性震顫、運動遲緩、姿勢不穩、肌強直和步態障礙，病理特征為中腦黑質DA能神經元進行性變性缺失。本實驗MPTP注射后小鼠出現震顫、豎毛、翹尾、活動減少等行為學特征，黑質區TH陽性神經元丟失嚴重〔7〕，提示PD模型成功復制。

研究表明PD發病與細胞凋亡關系密切〔8～11〕，凋亡途徑中細胞膜表面的凋亡受體激活caspase-8，進而激活凋亡的最終執行者caspase-3。本實驗模型組MPTP注射后黑質區出現大量caspase-3陽性細胞，其蛋白表達及caspase-3酶活性也明顯升高，同時伴有黑質TH蛋白表達水平降低，提示caspase-3參與的凋亡反應可能是DA能神經元變性丟失的關鍵。

PD的發生發展涉及細胞內絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉導通路。MAPK家族的主要成員ERK1/2是一種位于胞漿的蛋白激酶，一旦被激活,ERK1/2迅速穿過核膜并通過磷酸化反應調節某些轉錄因子的活性引起特定蛋白的表達或活性改變,最終影響細胞的生物學效應〔12〕。研究證實p-ERK1/2上游激酶特異性抑制劑可抑制Thrombin誘導的中腦黑質DA能神經元caspase-3表達〔5〕，提示caspase-3可能受p-ERK1/2調控。因此本實驗分析了p-ERK1/2、caspase-3和TH在MPTP所致PD模型小鼠黑質區的表達情況，免疫組化結果發現模型組6 h p-ERK1/2出現明顯核轉位，而caspase-3此時有顯著表達。U0126是ERK1/2信號通路的特異性抑制劑，研究表明它具有神經保護作用〔13〕。

本研究認為，MPTP可誘導中腦黑質p-ERK1/2分子激活，啟動了caspase-3表達及凋亡反應,最終導致DA能神經元變性丟失；抑制劑U0126阻斷了p-ERK1/2活化，使caspase-3表達減少，最終減輕了MPTP介導的DA能神經元損傷?？傊?，MPTP誘導的PD小鼠模型中，p-ERK1/2可能調控caspase-3表達，而抑制p-ERK1/2通路對DA能神經元可能具有神經保護作用。

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〔2014-06-19修回〕

(編輯安冉冉/曹夢園)

中圖分類號〔〕R745.7〔

文獻標識碼〕A〔

文章編號〕1005-9202(2015)24-7046-03；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2015.24.035