中空纖維三相液相微萃取熒光光度法測定綠豆芽中的吲哚類植物生長素

陳　露，吐爾洪·買買提，木尼熱·阿布都艾尼,謝爾艾力·加帕爾

(新疆大學　化學化工學院　石油天然氣重點實驗室，新疆　烏魯木齊　830046)

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中空纖維三相液相微萃取熒光光度法測定綠豆芽中的吲哚類植物生長素

陳露，吐爾洪·買買提*，木尼熱·阿布都艾尼,謝爾艾力·加帕爾

(新疆大學化學化工學院石油天然氣重點實驗室，新疆烏魯木齊830046)

摘要：基于中空纖維液相微萃取技術，建立了綠豆芽中吲哚類植物生長素的熒光檢測方法。通過L9(34)正交實驗，對中空纖維液相微萃取條件進行優化，得到的優化條件為：樣品溶液的pH值調為 4.0，萃取溶劑為正辛醇，接受相為pH 12.0的NaOH，攪拌速度為1 000 r/min，萃取時間為60 min。在最優萃取條件下，吲哚類植物生長素的富集倍數可達 92 倍。供體相中吲哚類植物生長素的質量濃度在 1.71~50.0 mg/L范圍內呈良好的線性關系，相關系數為0.997 9，檢出限(S/N=3)為0.57 mg/L，樣品的加標回收率為88.6%~100.7%，相對標準偏差(RSD)不大于 4.8%。該方法操作簡單，環境友好，可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素含量的準確快速測定。

關鍵詞：中空纖維三相液相微萃??；吲哚類植物生長素；正交實驗；熒光光度法；綠豆芽

圖1　吲哚類植物生長素的結構示意圖Fig.1　Molecular structure of indole phytohormonesn=1, 2, 3 represented IAA, IPA, IBA, respectively

植物生長素是植物體內微量存在并調控植物生長﹑分化和發育的化合物[1]。吲哚類植物生長素是最先發現的可促進植物生長的植物激素[2]，主要包括吲哚乙酸(IAA)﹑吲哚丙酸(IPA)和吲哚丁酸(IBA)，它們由不飽和芳香環和吲哚側鏈環組成[3]，其結構如圖 1 所示。由于植物體內生長素的含量很低[4]，并且容易被熱、光和氧降解，許多干擾基質也會影響其直接測定，因此分離和富集對生長素含量的測定顯得尤為重要[5]。

提取植物激素的常用富集技術有固相萃取(SPE)[6]﹑固相微萃取(SPME)[7]﹑微波輔助萃取[8]﹑液相微萃取(LPME)[9]等。傳統的富集技術不僅操作繁瑣耗時，而且需使用大量的有機溶劑，難以實現自動化[10]。SPME雖然可以克服上述缺點，但使用成本高，存在交叉污染，不能直接與高效液相色譜(HPLC)聯用，因此應用受到限制[11]。以多孔中空纖維為載體的液相微萃取(HF-LPME)是 20 世紀 90 年代由 Pederson-B jerggaard 首次提出的萃取技術[12]，主要是通過有機溶劑在纖維壁孔中形成的液膜進行傳質，在多孔的中空纖維腔內進行萃取[13]。中空纖維液相微萃取集采樣、萃取和濃縮于一體，具有富集倍數高、有機溶劑消耗少、樣品凈化能力強等優點，是一種環境友好的樣品前處理技術[14]，已被廣泛應用于食品[15]、環境[16]、醫學[17]等領域。

熒光檢測分析具有高靈敏度、高選擇性、操作簡單等優點[18-19]，適合于植物生長素的測定，Liu等[20]通過同步熒光法測定了果汁中 IAA 和 2-萘氧乙酸(BNOA)的含量。本文將三相中空纖維液相微萃取與熒光檢測結合測定了綠豆芽中的吲哚類植物生長素，該方法簡化了樣品前處理過程，縮短了分析時間，提高了分析效率，使用少量的有機溶劑有效去除了基質中復雜的干擾組分，簡單快速，可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素的痕量測定。

1實驗部分

970CRT熒光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)；KQ5200B 超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；UV-1800紫外可見分光光度計(日本島津公司)；1810-B 型石英自動雙重純水蒸餾器(上海市中晨數字技術設備有限公司)；pH 211 型酸度計(HANNA instruments)，HC-2062 型高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；磁力攪拌器(法國，IKA color squid)；Accurel Q 3/2 聚丙烯中空纖維(Membrana GmbH，Wuppertal，德國；壁厚 200 μm，孔徑 0.2 μm，內徑 600 μm)。

IAA、2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-D)、9-蒽甲醇(9-NA)、1-萘乙酸(1-NAA)、1-芘丁酸(1-PBA)均購自百靈威科技有限公司，氫氧化鈉、無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、甲醇、正辛醇等購自國藥集團化學試劑有限公司，所有試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水(自制)。

1.2實驗方法

1.2.1綠豆芽的培育稱取100 g 綠豆置于200 mL 燒杯中，用蒸餾水洗凈，置于暗處，提供適宜的溫度和濕度，每天定時換水2~3次，3天后，收集生長的豆芽，于-20 ℃下儲存備用。

1.2.2綠豆芽中植物生長素的提取取5 g 按上述方法培育的綠豆芽研磨，加20 mL NaH2PO4-H3PO4(pH 9.0)緩沖溶液，并在4 ℃ 下于暗處過夜提取植物生長素。然后將提取液在高速離心機中離心(9 000 r/min，5 min)，收集上清液。逐滴加入1 mol/L的HCl，調上清液至所需pH值。

圖2　中空纖維液相微萃取示意圖Fig.2　Scheme of hollow fiber-liquid phase microextraction

1.2.3中空纖維萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素將放有微型攪拌磁子的玻璃瓶固定于磁力攪拌器上，加入8 mL 樣品溶液，將中空纖維截成約8 cm長的小段，在丙酮中超聲清洗10 min，以去除中空纖維表面的雜質，然后將中空纖維用N2吹干。將中空纖維小段在正辛醇中浸泡5 min，使纖維孔壁充滿正辛醇，取出中空纖維后，用移液槍向中空纖維管內定量注入一定濃度的NaOH溶液作為接受相，然后將中空纖維迅速浸入到樣品溶液中，用封口膜將進樣口兩端密封，開啟恒溫磁力攪拌器，在一定攪拌速度下萃取一定時間后，用移液槍抽取50 μL 接受相，并定量稀釋，以激發波長λex=294 nm，測定發射波長λem=360 nm 處的熒光強度，根據熒光強度計算綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量。實驗裝置如圖2所示。

1.2.4正交實驗為了更加有效地利用中空纖維萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素，建立 L9(34)正交實驗水平因素表，以萃取時間、轉速、接受相NaOH的pH值和給體相HCl的pH值作為考察因素，通過單因素實驗，選出影響綠豆芽中吲哚類植物生長素提取效果的各因素中有意義的三水平，進行正交實驗(見表1)，優化萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素的最佳測定條件。

針對上述問題,為了消除不匹配的線路電阻和不對稱負荷對電流分配的影響,本文提出了一種基于自適應虛擬阻抗的分布式控制策略。該控制策略在傳統下垂控制的基礎上,結合本地和相鄰DG單元輸出的電流和初始虛擬阻抗值,根據系統特性自動調節等效輸出虛擬阻抗,使接口變流器的虛擬電阻與線路電阻的和逐漸收斂于相同值,以實現電流的動態均衡分配。另外,虛擬阻抗控制中由于線路電阻的影響帶來的電壓偏移,則通過添加電壓控制器利用動態一致性觀察法進行補償。

表1　正交實驗設計

2結果與討論

2.1分配系數的測定

分配系數(Ka/d)直接影響富集倍數、加標回收率的大小。研究表明，兩相LPME只用于親脂性高或中等的化合物分析，其Ka/d通常大于 500，不適用于親水的中性分析物；而對于酸堿性分析物，需要三相LPME，通過控制供體相和接受相的 pH 值，使分析物以非離子化狀態存在，來提高分配系數。吲哚乙酸﹑吲哚丙酸和吲哚丁酸的分子結構中均含有羧基，故選用三相 LPME 模式。以IAA 為代表物對兩相間的分配情況進行考察，首先用等體積的正辛醇萃取 50 mg/L 的IAA-HCl溶液(pH 4.0)，萃取完成后，收集有機層和HCl供體相，在λmax=280.0 nm 處測定吸光度。然后在有機層中加入等體積的 NaOH(pH 12.0)反萃取，再收集有機層和NaOH接受相，在λmax= 280.0 nm 處測定吸光度。根據中空纖維三相液相微萃取分配系數的定義，Ka/d=Korg/d×Ka/org，其中Ka/d為分配系數，Korg/d為萃取達平衡時分析物在有機相的濃度與在樣品中濃度的比值，Ka/org為萃取達平衡時分析物在接受相中的濃度與在有機相中濃度的比值。計算可知，Korg/d=10.62，Ka/org=12.43，分配系數為132.29。結果表明，分析物在從水相萃取到有機相，然后從有機相反萃取到水相的過程中，均有較高的萃取率，可采用該體系萃取綠豆芽中的吲哚類植物生長素。

2.2萃取條件的優化

表2　實驗方案與結果

植物激素的提取液通常選用有機溶劑[21]，如符繼紅等[22]采用 80%的甲醇溶液對擬南芥中的生長素進行提取，Wang等[5]用80%的甲醇對綠豆樣品進行預處理。本研究選擇NaH2PO4-H3PO4緩沖溶液作為提取液，分析物經該緩沖溶液提取后，可直接作為給體相進行萃取，而用有機溶劑提取時，需先將有機溶劑蒸出，再將分析物重新用水相溶解配制給體相才能萃取。

吲哚類植物生長素包括吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸等都具有吲哚環骨架結構特征。紫外分光光度計和熒光分光光度計均可用于其測定分析，但因其在植物體內含量很低，加之紫外檢測器的靈敏度較低，故本研究選用熒光分光光度計進行測定。

正交實驗的結果列于表2。從極差分析結果可看出，RC>RD>RB>RA，4個因素對提取率的影響大小依次為：NaOH的pH值(C)>HCl 的pH值(D)>轉速(B)>萃取時間(A)，其中接受相NaOH的pH值影響較為顯著。中空纖維萃取的最佳條件為A1B3C3D3：即萃取時間為60 min,轉速1 000 r/min，接受相NaOH的pH值12.0，樣品的pH值為4.0 。按 A1B3C3D3條件進行3次平行實驗，平均值為3.71 mg/L，高于表2中其他測試結果，故選擇A1B3C3D3為最佳萃取條件。

根據萃取過程分析，吲哚類植物生長素先被萃取到萃取劑正辛醇中，隨后在中空纖維界面遇堿離子化，再被反萃取到接受相NaOH中，從而實現對吲哚類植物生長素的選擇性富集。吲哚類植物生長素分子結構中含有羧基，當供體相pH值為4.0 時，它們大部分以分子狀態存在，極性減弱，減少了其在水中的溶解度，進而增大了在萃取劑正辛醇中的分配。隨著接受相NaOH 濃度的增大，吲哚類植物生長素的離子化狀態逐漸增加，極性也隨之增加，當接受相的pH值為12.0時，吲哚類植物生長素達到最大離子化狀態，大大降低了其在正辛醇中的溶解度，增大了在接受相中的溶解度，因此可以獲得最佳的萃取效率。

2.3線性范圍與檢出限

圖3　不同濃度加標樣品的熒光光譜圖Fig.3　Fluorescence spectra of series spiked solutionλex/λem=294/360 nm；spiked concentration(1-6)：0,5,10,15,30,50 mg/L；insert：calibration curve

對綠豆芽提取液樣品進行梯度加標實驗，分別配制0,5,10,15,30,50 mg/L的加標樣品，在最優萃取條件下測定，以熒光強度(F)對吲哚類植物生長素的質量濃度(ρ，mg/L)進行線性回歸，標準曲線如圖3插圖所示。方法的線性范圍為 1.71~50.0 mg/L，線性方程為F=14.264ρ+21.083，相關系數為0.997 9，檢出限(S/N=3)為0.57 mg/L。

2.4富集倍數與精密度

富集倍數為萃取完成后接受相中分析物的濃度與萃取前樣品中分析物的起始濃度之比。選擇0.1 mg/L的IAA-HCl(pH 4.0)樣品溶液進行富集倍數的考察，在最優的萃取條件下平行測定3次，得到富集倍數為92，3次測定值的相對標準偏差(RSD)為 5.0%。

2.5加標回收率與相對標準偏差

為了驗證方法的準確性，在最優的萃取條件下進行加標回收實驗。綠豆芽提取樣品的加標濃度分別為5，15，30 mg/L，每個濃度平行測定3次，測定結果見表3。加標回收率為88.6%~100.7%，測定值的RSD為 1.8%~ 4.8%，表明該方法有較高的準確度和重現性，通過中空纖維液相微萃取能夠去除影響綠豆芽中吲哚類植物生長素測定的干擾物。

表3　綠豆芽樣品中吲哚類植物生長素的加標回收實驗結果

2.6實際樣品的測定

表4　綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量

按照本方法對自培和購買的綠豆芽進行樣品前處理，在最優的萃取條件下分別測定了兩種綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量，平行測定3次，測定結果見表4，測定值的RSD均不大于1.6%。自培和市售綠豆芽中吲哚類植物生長素的含量分別為7.25 μg/g 和8.20 μg/g,說明該方法可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素的測定。

表5　方法的干擾實驗

2.7干擾實驗

為了驗證方法的可行性，進行干擾實驗。干擾物的選擇根據：①樣品中可能存在，并具有與目標化合物相近的物理化學性質和生物活性的物質，如2,4-D、1-NAA等生長素；②具有熒光性質的酸性化合物，如9-NA 和 1-PBA，因為這類物質可能會與目標化合物一起被萃取與檢出。一般樣品中干擾物與目標物濃度水平相當，本文選擇兩者濃度比例為10∶1，而且干擾物濃度大于其最大濃度值。向8 mL 綠豆樣品中分別加入 IAA、2,4-D、1-NAA、9-NA 和1-PBA 的甲醇標準溶液，IAA濃度為10 mg/L，其余化合物濃度均為100 mg/L，在最優條件下萃取后測定，結果見表5。結果顯示，當綠豆樣品中添加IAA 標品時，接受相的熒光強度比空白綠豆樣品增加了141.38，而添加物為2,4-D、1-NAA、9-NA 和 1-PBA時，1-NAA引起的熒光強度變化最大，但其值僅為10.86;表明2,4-D、9-NA 和 1-PBA的加入基本不使熒光強度發生變化，由此可見，干擾物對吲哚類植物生長素的測定幾乎無影響。

2.8測定方法對比

將HF-LPME與已有方法進行對比，結果見表6。本方法的相關系數(0.997 9)高于其他方法,RSD小于SPE/GC-MS、MWCNT-HPLC和MAG-MIP-HPLC等方法，說明本方法獲得數據可以與HPLC、GC-MS 等高端儀器測得的數據相媲美，且該方法簡單、快捷、重現性好，可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素含量的測定。

表6　HF-LPME與其它方法的對比

a:hollow fiber-liquid phase microextraction-fluorescence;b:solid phase extraction/gas chromatography-mass spectrometry;c:multi-walled carbon nanotube-high performance liquid chromatography;d:molecularly imprinted monolayer-surface plasmon resonance, e:magnetic molecularly imprinted polymer-high performance liquid chromatography, f:high performance liquid chromatography-chemiluminescence

3結論

本文通過正交試驗，優化了中空纖維萃取綠豆芽中吲哚類植物生長素的最優條件，同時建立了吲哚類植物生長素的熒光檢測分析方法。取50 μL萃取完成后中空纖維中的接受相，用高純水稀釋至500 μL，在λex/λem=294/360 nm處測定熒光強度，用本方法萃取綠豆芽中的吲哚類植物生長素，操作簡單﹑方便快捷，其線性范圍為1.71~50.0 mg/L(r=0.997 9)，檢出限為0.57 mg/L，富集倍數為92，加標回收率不小于88.6%。該方法可用于綠豆芽中吲哚類植物生長素含量的測定。

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Spectrofluorimetric Determination of Indole Phytohormones in Bean Sprout Using Three Phase Hollow Fiber-Liquid Phase Microextraction

CHEN Lu, TURGHUN Muhammad*, MUNIRA Abuduani, SHIRALI Jappar

(College of Chemistry & Chemical Engineering, Xinjiang University, Key Laboratory of Oil and Gas Fine Chemical,Educational Ministry of China, Urumqi830046, China)

Abstract：A new method using three phase hollow fiber-liquid phase microextraction was developed for the determination of indole phytohormones in bean sprout by spectrofluorimetry.The parameters affecting liquid phase microextraction performance were optimized using L9(34)orthogonal experiment.The optimum extraction was achieved by adjusting sample solution pH value to 4.0, using 1-octanol as organic extraction solvent, pH 12.0 solution as acceptor phase, and stirring the solution at 1 000 r/min for 60 min.Under the optimum conditions, the calibration curve showed a good linearity(r=0.997 9) in the range of 1.71-50.0 mg/L, with a detection limit of 0.57 mg/L.Recoveries for spiked samples from 88.6%to 100.7%were obtained with RSDs not more than 4.8%.The proposed method was simple, green and accurate in the determination of indole phytohormones in bean sprout.

Key words：hollow fiber three phase liquid phase microextraction;indole phytohormones;orthogonal experiment;spectrofluorimetry;bean sprout

中圖分類號：O657.3；S963.732

文獻標識碼：A

文章編號：1004-4957(2016)02-0229-06

doi:10.3969/j.issn.1004-4957.2016.02.016

*通訊作者：吐爾洪·買買提，博士，教授，研究方向：分析化學，Tel:0991-8582654，E-mail:turghunm@sina.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(21365020；21565025)

收稿日期：2015-07-15；修回日期：2015-08-19