黃酒酒曲中霉菌篩選及其制曲研究

俞劍燊,楊昳津,夏永軍,胡 健,方逸群,艾連中*

(1.上海金楓酒業股份有限公司,上海 200120;2.上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海 200093;3.上海黃酒工程技術研究中心,上海 200093)

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黃酒酒曲中霉菌篩選及其制曲研究

俞劍燊1,3,楊昳津2,3,夏永軍2,3,胡 健1,3,方逸群1,3,艾連中2,3*

(1.上海金楓酒業股份有限公司,上海 200120;2.上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海 200093;3.上海黃酒工程技術研究中心,上海 200093)

摘要：從上海地區黃酒企業的主發酵液、麩皮、生麥曲和自然塊曲中分離出22株霉菌,經透明圈平板初篩和制曲實驗復篩,得到3株高產糖化酶、淀粉酶和蛋白酶的曲霉菌株BR84、BR88和BR100。BR84和BR100菌株混合制曲有最高的酶活力,糖化酶、液化酶和蛋白酶活力分別達1099.82、80.65、284.44 U/g。以篩選出的曲霉進行混合制曲并進行黃酒模擬發酵,發現混合制曲發酵黃酒中還原糖和氨氮的生成速率顯著高于純種制曲的。

關鍵詞：黃酒;制曲;霉菌；篩選；混合菌種;酶活力

黃酒是以糯米、小米和玉米等谷物為主要原料,經過蒸煮、糖化、發酵、壓榨、過濾、煎酒、陳化等工藝而制成的釀造酒[1]。黃酒含有多種氨基酸、維生素、多肽以及活性多糖等活性成分?！耙喳溨魄?用曲釀酒”是中國黃酒的特色,麥曲在黃酒釀造中有“酒之骨也”的美稱[2]。麥曲質量的優劣直接影響到黃酒的產量和質量,在黃酒發酵中,麥曲具有復合糖化粗酶制劑的功能,并且賦予了黃酒獨特的色、香、味。

麥曲分為自然塊曲和生麥曲,前者采用自然接種發酵的方式制得,后者是在傳統制曲的基礎上發展而成,利用熟料接種純種霉菌進行培養[3]。自然塊曲網羅了多種微生物,含有豐富的微生物群落和酶系,釀成的酒口味醇厚,香氣較濃,但曲中主要酶類的活性都較低;生麥曲中淀粉酶活性得到了顯著提高,但由于菌種單一,酶系簡單,釀成的黃酒口味寡淡,雜味較重[4]。霉菌是酒曲中的主要微生物,提供豐富的微生物酶系,主要有:液化酶(也稱α-淀粉酶)、糖化酶(也稱葡萄糖淀粉酶)和蛋白酶[5]。淀粉酶把淀粉質原料分解為低分子可發酵性糖,為酵母等微生物提供碳源及能量;蛋白酶將原料中的蛋白質分解為肽和氨基酸等營養物質,在為微生物的生長、繁殖提供營養物質的同時,也是黃酒中風味物質形成的前體。

近年來,黃酒企業隨著新舊工藝的切換與轉變,其在生產上使用的霉菌由于時間過久不斷出現退化的現象,因而篩選性能優良的霉菌菌株是黃酒生產中亟需解決的問題。而通過多菌種混合制曲,有望改善黃酒麥曲的品質。

1材料與方法

1.1實驗材料

1.1.1原料主發酵液、麩皮、生麥曲、自然塊曲，由上海金楓酒業股份有限公司提供。

1.1.2培養基YPD瓊脂培養基:葡萄糖20 g/L、酵母浸粉10 g/L、蛋白胨20 g/L、瓊脂2%，于121 ℃下滅菌20 min,冷卻后備用。淀粉酶透明圈培養基:可溶性淀粉5 g/L、NaCl 5 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母浸粉10 g/L、瓊脂2%，于121 ℃下滅菌20 min,冷卻后備用。蛋白酶透明圈培養基:脫脂乳20 g/L、瓊脂2%，于121 ℃下滅菌20 min,冷卻后備用。

1.1.3主要試劑3,5-二硝基水楊酸、福林酚試劑、可溶性淀粉、三氯乙酸、酪氨酸等,均為分析純。

1.1.4主要儀器3-18 K型離心機,德國Sigma公司; PB-10普及型pH計,德國Sartorius公司;分光光度計,上海美普達有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1霉菌分離、純化與保藏在收集到的樣品中加入一定量的無菌生理鹽水，進行振蕩,制成10倍至106倍的稀釋液；然后進行涂布,于28 ℃培養箱中培養2～3 d；挑取可疑單菌落，多次純化后接入試管斜面上，于4 ℃下保存。

1.2.2平板透明圈法將經分離純化后的霉菌分別點植于產淀粉酶和蛋白酶的平板上,在可溶性淀粉與脫脂乳粉被霉菌分泌的淀粉酶與蛋白酶分解后,對淀粉酶平板用碘液進行顯色,菌落周圍產生透明圈,透明圈直徑越大,表明菌株具有越強的產淀粉酶或蛋白酶的能力。

1.2.3制曲實驗將麩皮與水以1∶1.5的比例進行配料,攪拌均勻后在121 ℃下滅菌20 min；在自然冷卻后,以10%的接種量接入由斜面制成的孢子懸浮液,攪拌均勻后置于28 ℃下培養；在培養18～20 h后長出菌絲時進行第一次搖瓶,之后每隔一段時間搖瓶一次；待孢子成熟時,培養結束,全過程需時約72 h。提取粗酶液，測定所制得種曲的糖化酶、液化酶以及酸性蛋白酶的活力。

1.2.4霉菌的分子鑒定根據參考文獻[6],提取基因組DNA,并用作PCR擴增的DNA模板。rDNA-ITS序列擴增以及測序所用的引物為ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[8],由上海生工生物工程技術有限公司合成。PCR反應體系(20 μL): ddH2O 13.0 μL,10×Taq Buffer 2.0 μL,上游引物(20 μmol/L) 0.5 μL,下游引物(20 μmol/L)0.5 μL, Mg2+(25 mmol/L)1.5 μL, dNTP(10 mmol/L) 0.5 μL,Taq DNA聚合酶(5 U/L) 1.0 μL,模板1.0 μL。反應條件為:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min,共35個循環;72 ℃ 10 min。

1.2.5黃酒的模擬發酵實驗稱取1000 g糯米，浸泡2 d,蒸熟后置于2 L廣口試劑瓶中,加入水700 mL、麥曲100 g、酒母200 mL,拌勻,置于28 ℃培養箱中發酵 4 d，然后再轉移至 15 ℃培養箱中繼續發酵11 d。在發酵過程中定時取樣,將發酵醪液過濾并離心后取上清液進行常規釀造指標的測定。

1.3分析方法

1.3.1糖化酶活力的測定 酶活定義:1 g曲經緩沖液提取后的粗酶液在40 ℃、pH 4.6條件下每分鐘分解可溶性淀粉產生1 mg麥芽糖為1個酶活單位,以U/g表示。具體測定方法參照文獻[7]。

1.3.2液化酶活力的測定采用鈍化法[8]測定。酶活定義同1.3.1。

1.3.3酸性蛋白酶活力的測定采用劉穎等[9]的測定方法。酶活定義:1 g曲經緩沖液提取后的粗酶液在40 ℃條件下麥面中水解產生1 μg酪氨酸為1個酶活單位,以U/g表示。

1.3.4酸度的測定參照中華人民共和國國家標準GB/T 13662─2008,采用NaOH直接滴定法[10]。

1.3.5還原糖的測定以3,5-二硝基水楊酸法[11]測定發酵液中的還原糖濃度。

1.3.6乙醇含量的測定具體參照黃媛媛等[12]的測定方法。

2結果與分析

2.1黃酒酒曲中霉菌的分離篩選結果

從收集到的黃酒酒曲中共分離出22株霉菌,通過產淀粉酶和產蛋白酶的初篩培養基以透明圈法進行初篩,結果如表1所示。由表1可知：有11株具有產淀粉酶能力的菌株和9株具有產蛋白酶能力的菌株；其中有6株既能產淀粉酶也能產蛋白酶的菌株,分別為BR84、BR86、BR88、BR92、BR97和BR100。

2.2單菌株制曲的酶活力比較

對初篩得到的6株菌制曲后,提取粗酶液進行酶活力的測定,結果如圖1所示。相較于BR86、BR92和BR97菌株, BR84、BR88和BR100菌株的糖化酶活力高出了100 U/g,表明由這3個菌株制得的曲分解淀粉為低分子可發酵性糖的能力較強。BR97菌株具有最高的酶活力,達到91.13 U/g,比其他5個菌株平均高出20 U/g。BR88具有最高的酸性蛋白酶活力,為290 U/g; BR100菌株次之,為242.22 U/g; BR84和BR86菌株的蛋白酶活力較低,分別為53.89和56.67 U/g; 而BR92和BR97的蛋白酶活力很低，分別僅為2.78和5.56 U/g。

經過蛋白酶、糖化酶、α-淀粉酶活力的綜合比較,可知BR84、BR88和BR100三株菌有較為突出的酶活性。其中, BR84具有較高的糖化酶活力,酸性蛋白酶活力一般; BR88具有較強的糖化酶活力和酸性蛋白酶活力,α-淀粉酶活力一般； BR100的糖化酶、α-淀粉酶和蛋白酶活力均較高。為了進一步探究混合菌株的制曲效果,選出BR84、BR88和BR100進行混合制曲。

注：“+”表示透明圈明顯；“-”表示沒有透明圈。

2.3混合制曲的酶活力比較

對BR84、BR88和BR100進行兩兩組合混合制曲,酶活力比較結果如圖2?？芍?混合菌株制曲的蛋白酶和淀粉酶活力較單菌株制曲均有了顯著的提高。其中BR100和BR84+BR100兩組麥曲具有較為突出的糖化酶活力,分別為1023.87和1099.82 U/g，明顯高于BR84、BR88、BR84+88、BR88+BR100的糖化酶活力,為720～890 U/g。BR84+BR100組麥曲具有最高的α-淀粉酶活力,為80.65 U/g；其余5組菌株制曲的α-淀粉酶活力則較為相近。BR84+BR100組麥曲亦具有最高的酸性蛋白酶活力,為284.44 U/g; BR84和BR84+BR88次之,均為201.11 U/g; BR88+BR100組麥曲的酶活力最低,僅為54.4 U/g。

綜上所述, BR84+BR100組麥曲具有較為突出的糖化酶、液化酶和蛋白酶活力,故以該組菌株組合制曲后進行黃酒模擬發酵實驗,探究組合制曲對黃酒釀造結果(酒度、酸度、還原糖和氨氮含量)的影響。

2.4分子鑒定結果

隨著分子生物學技術的發展和廣泛應用,核糖體RNA基因的內轉錄間隔區也被廣泛地應用于真菌的分類與鑒定。對篩選結束后得到的BR84、BR88和BR100菌株進行基因組DNA的提取,使用引物ITS1/ITS4對上述3株菌進行擴增,電泳圖譜如圖3所示。其中BR100菌株的擴增產物濃度較BR84和BR88菌株的高,3株菌的PCR擴增產物片段大小約為600 bp,與ITS目標序列的長度一致。將擴增產物進行測序,利用序列BLAST搜索NCBI核酸數據庫,獲取與其同源的其它酵母菌株的ITS序列,確定BR84為黃曲霉(Aspergillusflavus), BR88為米曲霉(Aspergillusoryzae), BR100為黃曲霉(Aspergillusflavus)。

2.5黃酒模擬發酵實驗結果

在混合制曲與工廠菌株制曲后進行黃酒模擬實驗，在發酵過程中的理化指標如表2。由表2可以看出：隨著發酵時間的延長,黃酒的酒度、酸度和氨氮含量均逐漸增加,還原糖含量則逐漸降低；在發酵結束后,兩組黃酒的酒度并沒有顯著性差異；還原糖含量在發酵初期迅速降低，爾后表現為緩慢減少。BR84和BR100混合制曲發酵得到的黃酒,其酸度含量在發酵全程中均比工廠菌株高出3%～9%,氨氮含量則高出38%～95%。在發酵1 d后,混合制曲組的還原糖含量為158 g/L,而工廠菌株組為124 g/L,前者比后者高出了27.42%,這主要是由于混合菌株制曲的淀粉酶系活力明顯高于工廠菌株制曲的酶系活力。在黃酒釀造過程中呈典型的邊糖化邊發酵的“雙邊發酵”,發酵初期是酵母菌生長代謝最為活躍的時期；高糖化力的混合制曲組黃酒在發酵初期酵母菌對底物利用較為充分,因此有較高的酒度、酸度和氨氮含量。

3結語

麥曲是傳統黃酒糖化發酵的重要物質基礎,也是奠定黃酒風格的重要保障。其中含有豐富的微生物及酶系,對黃酒發酵的質量和黃酒的風味都起到舉足輕重的作用。從黃酒的發酵液、麩皮、小麥、生麥曲和自然塊曲中分離曲霉等主要糖化菌,通過純種制曲和混合菌種制曲并測定酶活力，進行篩選后進行了黃酒模擬小試試驗。結果表明,混合菌種制曲,既能保持黃酒既有的工藝特色,又能提高原料的利用率,增加營養,可用于黃酒釀造的規?；a。

參考文獻:

[1] 汪建國,沈玉根,陸偉杰,等.我國黃酒研究現狀與發展趨勢[J].中國釀造,2012,31(11):15-19.

[2] 曹鈺,陸健,方華,等.紹興麥曲中真菌多樣性的研究[J].食品科學,2008,29(3):277-282.

[3] 壽泉洪.生麥曲和熟麥曲在黃酒生產中的應用研究[D].無錫:江南大學,2006.

[4] 余培斌,陳亮亮,張波,等.雙菌種制曲改善黃酒麥曲品質的研究[J].食品與發酵工業,2012,38(9):1-6.

[5] 劉磊,吳暉,劉冬梅,等.黃酒生產用純種根霉的篩選及其產酶條件的優化[J].中國釀造,2013,32(3):25-28.

[6] Helga O, Michael P C. Phylogenetic relationships ofPhytophthoraspecies based on ribosomal ITSl DNA sequence analysis with emphasis on Waterhouse groups V and Vl [J]. Mycology Research, 2000(9): 1055-1061.

[7] 方華.紹興黃酒麥曲中微生物的初步研究[D].無錫:江南大學,2006.

[8] 王學奎.植物生理生化實驗原理和技術[M].北京:高等教育出版社,2006:174-176.

[9] 劉穎,王佳瑞,劉婧美,等.米曲霉制備高蛋白酶活力醬曲工藝探討[J].現代食品科技,2009,35(9):1049-1052.

[10] GB/T 13662─2008,黃酒[S].

[11] 趙凱,許鵬舉,谷廣燁.3,5-二硝基水楊酸比色法測定還原糖含量的研究[J].食品科學,2008,29(8):534-536.

[12] 黃媛媛,肖蒙,彭金龍,等.快速酒精儀在黃酒酒精度分析中的應用[J].中國釀造,2014,33(4):139-141.

(責任編輯:黃榮華)

Studies on Screening of Mycetes from Koji for Chinese Rice Wine and Koji-making

YU Jian-shen1,3, YANG Yi-jin2,3, XIA Yong-jun2,3, HU Jian1,3, FANG Yi-qun1,3, AI Lian-zhong2,3*

(1. Shanghai Jinfeng Wine Limited Company, Shanghai 200120, China; 2. College of Medical Instrument and Food Engineering, University of Shanghai for Science and Technology, Shanghai 200093, China; 3. Shanghai Engineering Research Center of Chinese Rice Wine, Shanghai 200093, China)

Abstract：Twenty two strains were isolated from the main fermentation broth, bran, raw wheat koji and natural koji, three strains of mycetes named BR84, BR88 and BR100 which had high activity of amylase and protease were selected by the method of transparent circle and koji-making from Shanghai Jinfeng Wine Limited Company. The enzyme activities of the kojis made by mixed strains were measured and the koji made by BR84 and BR100 strains had the highest enzyme activity, saccharifying enzyme, liquefied and protease enzyme activity were 1099.82, 80.65, 284.44 U/g, respectively. Found that the formation rate of reducing sugar and ammoniacal nitrogen were significantly higher than that of pure starter-making.

Key words：Chinese rice wine; Koji making; Mycete; Screening; Mixed-strains; Enzyme activity

收稿日期：2015-10-27

基金項目：上海市農業科技成果轉化資金項目(133919N1000);上海理工大學橫向項目(js-010-zx004);上海市研究生創新基金項目(JWCXSL1402)。

作者簡介：俞劍燊(1974─),男,江蘇無錫人,高級工程師,碩士,從事釀造微生物選育研究工作。*通訊作者：艾連中。

中圖分類號：TQ925.7

文獻標志碼：A

文章編號：1001-8581(2016)05-0079-04