乳酸菌與米曲霉醬油共制曲的研究

鐘方權，黃瑤，沈婉瑩，付彬，汪超，徐寧

(湖北工業大學 生物工程與食品學院 湖北省食品發酵工程技術研究中心,武漢 430068)

醬油是產量最大、應用最廣泛的發酵豆類制品,內含氨基酸、糖類、維生素等多種營養成分[1]。它是以大豆或脫脂大豆、小麥或麩皮為原料，經微生物發酵而制成的具有特殊色、香、味的液體調味品[2]。我國醬油釀造普遍采用單一米曲霉制曲，但由于發酵過程是半開放式，發酵體系實際上是由多種微生物構成，參與的微生物種類繁多，發酵過程中微生物群落不斷地演替變化，最終完成大分子原料的降解、轉化、代謝等過程[3]。復雜的微生物群落產生了豐富的有機酸、氨基酸、脂肪酸、醇、酯、酚等代謝產物，故復雜但有規律的微生物群落組成是賦予傳統釀造調味食品獨特風味品質的關鍵[4,5]。這些微生物來自幾十種細菌和真菌種屬，例如乳桿菌屬、魏斯氏菌屬、腸球菌屬、曲霉菌屬、球擬酵母屬等[6-9]。

目前關于多菌種制曲發酵以及添加其他風味微生物參與醬油釀造的研究較多，添加的菌種主要集中在曲霉菌(如黑曲霉)、紅曲菌、耐鹽的風味酵母和耐鹽乳酸菌等[10-12]。而大量的研究證實在醬油曲料的微生物群落分析中有大量的非耐鹽乳酸菌，而對于非耐鹽乳酸菌對于醬油曲料品質以及最終醬油中活性物質的影響尚不明確，因此，本研究通過在制曲過程中添加篩選自醬油中的非耐鹽乳酸菌(耐腸球菌)，研究其對制曲酶活力的影響，為探索醬油微生物菌群的作用奠定了研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米曲霉(Aspergillusoryzae)AS3.951、乳酸菌(耐腸球菌Enterococcusdurans)：保藏于湖北工業大學湖北省食品發酵工程技術研究中心；豆粕：市售；焙炒小麥：自行炒制。

福林酚、酪蛋白、羧甲基纖維素鈉、3，5-二硝基水楊酸、D-半乳糖醛酸等試劑：購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 主要儀器設備

UV-1601紫外可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司;CT15RE高速冷凍離心機 日立工機株式會社；MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋 松下健康醫療器械株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 米曲霉和乳酸菌的培養

米曲霉在豆汁培養基上接種并進行2次傳代后，在32 ℃培養72 h，再將其轉接到三角瓶固態培養基中培養72 h，每克曲料中孢子數約7.0×109個，置于4 ℃冰箱保存待用。耐腸球菌在MRS培養基活化2次后，于33 ℃搖床培養至對數期，菌落總數約為1.0×1010CFU/mL。

1.3.2 制曲工藝流程

豆粕加1.2倍水潤濕1 h后與一定比例的炒小麥混合均勻，于115 ℃高溫滅菌鍋滅菌20 min，冷卻至室溫，按一定接種比例接入米曲霉種曲和乳酸菌，隨后放入制曲室恒溫培養直至制曲結束，期間翻曲2次。單因素實驗條件見表1。

表1 單因素實驗條件

1.3.3 蛋白酶(中性、酸性)活力的測定

采用福林酚法測定蛋白酶活力[13]，中性蛋白酶的測定采用pH為7.2的磷酸緩沖液；酸性蛋白酶的測定在pH為3.0的乳酸鈉緩沖液中進行。在40 ℃下每分鐘水解酪蛋白產生1 μg 酪氨酸所需的酶量定義為1個蛋白酶活力單位。

1.3.4 纖維素酶活力的測定

纖維素酶活力的測定參照DNS顯色法[14]，酶活的定義：在40 ℃、pH 4.8條件下，每分鐘催化羧甲基纖維素鈉底物降解釋放1 μmol葡萄糖所需要的酶量為1個酶活力單位。

1.3.5 果膠酶活力的測定

果膠酶活力的測定同樣參考DNS顯色法[15]，酶活的定義：在40 ℃、pH 4.8條件下，每分鐘催化水解果膠釋放1 μg D-半乳糖醛酸所需要的酶量為1個酶活力單位。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 原料配比對曲料中酶活的影響

本研究選取豆粕和炒小麥為制曲原料，經炒制后的小麥減少了部分含水量，更有利于儲存，也可減少雜菌的生長，另外，高溫炒制可以使部分酶失去活性，蛋白質的適度變性更有利于微生物的吸收轉化，由于選取的原料中蛋白質含量以及纖維素果膠含量較高，所以選取中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶的酶活力為評價指標來優化制曲過程中最佳的原料配比，此外，制曲過程中所產酶系多樣化的研究，也可為后期醬油的發酵提供基礎數據。

原料配比對制曲過程中4種酶的影響規律見圖1。當原料豆粕與炒小麥的比例為6∶4時，曲料中中性蛋白酶、酸性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶的酶活力可達到最佳水平，為2195.65，612.43，47.72，25.48 U/g，且顯著優于其他組。因此，采用豆粕與炒小麥的比例為6∶4的制曲工藝生產的醬油品質更高。

圖1 不同原料比例對酶活的影響

2.1.2 米曲霉接種量對曲料中酶活的影響

圖2 不同米曲霉接種量對酶活的影響

由圖2可知米曲霉的接種量對曲料中4種酶活力的影響，隨著米曲霉接種量的增加，4種酶的活力在緩慢增加。在米曲霉接種量為0.5%時，成品曲料中的4種酶活力值達到最優，分別為2332.45，532.89，23.68，47.78 U/g。所以，當米曲霉接種量為0.5%時，能獲得更好的曲料。

2.1.3 乳酸菌接種量對曲料中酶活的影響

圖3 不同乳酸菌接種量對酶活的影響

由圖3可知不同乳酸菌添加量對4種酶活的影響，隨著乳酸菌接種量的增加，除中性蛋白酶外，其他酶都呈先增后減的趨勢。當乳酸菌接種量為1.0 mL/100 g(每1 mL菌液含有1.0×1010CFU/個乳酸菌)時，其成曲中中性蛋白酶可達到2034.53 U/g，比接種量為0.4 mL/100 g時降低了7%；但此時成曲中酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶分別為622.43，25.48，46.72 U/g，比接種量為0.4 mL/100 g的曲料組提高了1.02倍、1.16倍和1.13倍。由此可得，選取乳酸菌接種量為1.0 mL/100 g時最佳。

2.1.4 制曲溫度對曲料中酶活的影響

溫度對制曲品質的好壞至關重要。在當今的醬油實際釀造生產過程中，在制曲過程中，通常會采取通風培養方式，通風也是為了給好氧微生物如米曲霉提供足夠的氧氣，故控制通風量是控制溫度的關鍵操作技術。制曲溫度的不同對4種酶活的影響見圖4。

圖4 不同制曲溫度對酶活的影響

由圖4可知，在制曲溫度在36～39 ℃時，4種酶的酶活力大大下降，故此溫度控制尤為重要。當溫度保持在32～35 ℃之間時，醬油成品曲料中4種酶的酶活力達到最高水平，中性蛋白酶為2265.78 U/g，酸性蛋白酶為520.66 U/g，纖維素酶為25.44 U/g，果膠酶為46.67 U/g，因此， 32～35 ℃為最優的制曲溫度范圍。

2.1.5 制曲時間對曲料中酶活的影響

制曲時間的長短對曲料品質的影響也至關重要，制曲時間過短，酶系和產酶量可能不足，影響原料的使用率，降低成曲品質；制曲時間過長，酶的活力可能會下降且后期霉菌的大量繁殖、孢子的大量生成會影響成品醬油的色澤。

圖5 不同制曲時間對酶活的影響

由圖5可知，當制曲時間為36～44 h，可使成曲達到相對穩定的狀態，此時成曲中中性蛋白酶、酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶的酶活力分別為2182.53，613.43，24.58，47.68 U/g，且與40 h制備得到的成曲中酶系活力無顯著差異。因此，初步確定制曲時間為36～40 h。

2.2 制曲工藝的正交優化

本研究以5個因素(米曲霉接種量、乳酸菌接種量、原料配比、制曲時間、制曲溫度)、4種酶(纖維素酶、果膠酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶)的酶活力為評價指標，采取五因素四水平的正交試驗，采用正交試驗極差分析法研究最優的制曲工藝，結果見表2～表6。

表2 正交試驗

表3 中性蛋白酶酶活極差表

表4 酸性蛋白酶酶活極差表

表5 纖維素酶酶活極差表

表6 果膠酶酶活極差表

中性蛋白酶：各因素對其的影響順序為米曲霉接種量>乳酸菌接種量>原料配比>制曲溫度>制曲時間，最優的制曲條件為米曲霉接種量0.5%，乳酸菌接種量0.4 mL/100 g，原料配比5∶5，制曲溫度24～27 ℃，制曲時間44 h。酸性蛋白酶：各因素對其的影響順序為制曲溫度>米曲霉接種量>乳酸菌接種量>原料配比>制曲時間，最優的制曲條件為米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1.0 mL/100 g，原料配比5∶5，制曲溫度32～35 ℃，制曲時間40 h。纖維素酶：各因素對其的影響順序為制曲溫度>乳酸菌接種量>制曲時間>米曲霉接種量>原料配比，最優的制曲條件為米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1 mL/100 g，原料配比5∶5，制曲溫度32～35 ℃，制曲時間40 h。果膠酶：各因素對其的影響順序為制曲溫度>米曲霉接種量>制曲時間>原料配比>乳酸菌接種量，最優的制曲條件為米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1.0 mL/100 g，原料配比6∶4，制曲溫度32～35 ℃，制曲時間40 h。

因此，綜合考慮，確定制曲的最佳工藝條件為：米曲霉接種量0.4%，乳酸菌接種量1.0 mL/100 g，原料配比6∶4，制曲溫度32～35 ℃，制曲時間40 h。

3 結論

制曲過程中酶系的豐富程度以及酶活力的大小是決定后期醬油發酵過程中質量指標的關鍵，最終影響醬油的品質。本文選取酸性蛋白酶、中性蛋白酶、果膠酶和纖維素酶4種酶的酶活力為成曲曲料品質的評價指標，確定了乳酸菌與米曲霉共生制曲的最優工藝條件：原料中豆粕與炒小麥的比例為6∶4，制曲溫度為32～35 ℃，制曲時間為40 h，米曲霉的接種比例為0.4%，乳酸菌的添加量為1.0 mL/100 g。