葡萄籽提取物對高糖誘導系膜細胞肥大的抑制研究

鄭欣

【摘要】 目的 探究葡萄籽提取物（GSE）對高糖誘導系膜細胞肥大的抑制作用。方法 將大鼠系細胞膜分為常規組（NG組）、高糖組（HG組）和高糖聯合GSE（高、中、低）組， 對蛋白/細胞數量比值、細胞增殖、細胞周期變化和P21與P27表達情況進行分析。結果 將NG組為比較對象， 其他組在系膜通過高糖連續性培養2 d 后， 蛋白/細胞數呈現出上升趨勢， HG聯合中劑量GSE組和HG聯合大劑量組的細胞蛋白/細胞數比值呈現出下降趨勢， 差異有統計學意義（P<0.05）。將NG組為比較對象， 其他組經高糖培養48、72 h后， 系膜細胞的增值水平減弱， HG聯合中劑量GSE組和HG聯合大劑量組明顯高于HG組， 差異有統計學意義（P<0.05）。系膜細胞經過D-葡糖連續刺激2 d后， 兩種物質的蛋白質水平顯著提升， 差異有統計學意義（P<0.05）。經高糖聯合GSE處理后， 以單獨高糖組為研究對象， 證明GSE可全面對P21和P27起到抑制上升， 濃度存在依賴性， 差異有統計學意義（P<0.05）。系細胞膜經過高糖連續刺激48 h后， 細胞G0/G1期的比例顯著上升， 和S期相比顯著減少， 差異有統計學意義（P<0.05）。HG聯合中量GSE組和HG聯合高粱GSE組細胞的G0/G1比例下降， S期細胞明顯提升， 差異有統計學意義（P<0.05）。結論 GSE可全面抑制高糖誘導系細胞膜肥大， 證明該物質能夠全面緩解DN的疾病進展。

【關鍵詞】 高糖；系膜細胞肥大；葡萄籽提取物

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.17.195

糖尿病腎?。―N）發病機制較為復雜， 值得說明的是， 對1型和2型糖尿病患者的腎臟組織標本實施形態學分析可見， DN細胞在表型轉化先期主要特征為細胞異常肥大[1]， 其中又以系膜細胞肥大最為顯著， 且在DN病理后期和系細胞膜肥大之間存在關聯性。對高糖誘導系細胞膜肥大進行全面干預， 對于先期干預DN疾病進展、延長DN患者的生存時間有著非常重要的現實意義。GSE有著差異化生物活性， 有相關研究證實， 對于糖尿病大鼠使用一定劑量的GSE， 可提升腎臟功能水平。出現這種情況的原因和減少糖尿病小鼠糖基化參數、腎組織生長因子和提升腎臟抗氧化水平密切相關， 且當前鮮有文獻對葡萄籽提取物對DN的分子和細胞作用加以闡述。為了全面探究葡萄籽提取物對高糖誘導系膜細胞肥大的抑制情況， 本文聯系實際， 對該命題進行全面研究， 重點在于分析其作用分子機制， 現報告如下。

1 材料與方法

1. 1 材料 原青花素含量≥95%的 GSE， 大鼠系膜細胞， RIPM1640培養基， 胎牛血清（FBS）， D-葡糖， 兔來源抗P21CIP和P27KIP。

1. 2 方法 在培養液內加入青霉素， 濃度為10%的 FBS溶液， 鏈霉素溶液， 劑量均為100 U/ml， 將大鼠系膜細胞放置于上述培養液中， 混合完畢后， 將樣本放在37℃， 5%體積分數二氧化碳飽和濕度培養箱。在細胞出現單層貼壁生長后， 每2天實施傳代1次， 選擇對數生長期細胞作為本實驗原料。

1. 2. 1 分組原則 選擇適當密度對系膜細胞轉種， 在進行實驗以前， 使用FBS培養液1640進行同步培養， 在16 h后， 加入劑量不相同的GSE在FBS培養液中繼續培養48 h。本次實驗將所有樣本分成高糖組（HG組）， 正常組（NG組）， 高糖聯合GSE（高、中、低）組。實驗前， 將GSE分成1.5、10 mmol/L溶液， 實驗中以1∶1000為比例， 稀釋為1.5、10 μmol/L的GSE。

1. 2. 2 細胞增殖能力檢測 將對數系膜細胞加以收集， 調配好懸濁液濃度， 細胞種植在孔板內， 貼壁， 經16 h后， FBS同步， 更換新的培養液。將0、24、48、72 h視為觀察點， 對增殖情況進行觀察， 在此過程中， 吸去清液， 洗滌PBS， 棄置上清液。在每個小孔中加入新的培養液。后加入MTT液， 連續培養3 h， 后吸去孔內培養液。完畢后在孔內加入二甲基亞砜， 在恒溫環境下培養15 min， 等到晶體溶解后， 使用監測設備測量吸光值， 計算活細胞數量。

1. 2. 3 蛋白/細胞數計算 各組細胞在刺激48 h后， 胰酶消化細胞， 計算各個小組總細胞數量。離心， 置入Ep管內， 增加裂解液， 0℃環境留置30 min， 離心， 上清液為蛋白量。

1. 2. 4 細胞周期檢測 在各組細胞刺激48 h后， 洗滌PBS行雙重洗滌， 消化完畢后， 離心收集， 放置在離心管內， 選擇一定數量細胞， 使用酒精在4℃環境下固定， 連續12 h。計算前離心， 去掉乙醇， PBS雙重洗滌， 將上述物品碘化丙啶， 暗處染色， 時長為7.5 min， 使用細胞儀收集樣本， 經專業軟件進行相關分析。

1. 2. 5 P21CIP和P27KIP蛋白量檢測 選擇濃度為0.25%胰酶消化細胞， 離心， PBS雙重漂洗， 轉入EP管， 混合RIPA裂解液， 以0℃環境冰浴。共計0.5 h， 離心， 上清液為蛋白。

使用二喹甲酸（BCA）法對蛋白濃度進行測定。蛋白電泳， 后轉至聚偏氟乙烯（PVDF）膜， 使用麗春紅染色處理， BSA/TBST封閉， 溫度為4℃ ， 在60 min后， 加入經稀釋的P21CIP和P27KIP孵育12 h， 后使用TBST三重漂洗， 稀釋， 標記好的羊抗兔孵育1 h， 使用TBST行三重漂洗， 顯影， 膠片記錄。

1. 3 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件進行數據統計分析。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 各組系膜細胞膜蛋白/細胞數情況 將NG組（2.31± 0.15）μg×104為比較對象， 在系膜通過高糖連續性培養2 d 后， HG組蛋白/細胞數（3.20±0.19）μg×104呈現出上升趨勢， HG聯合中劑量GSE組和HG聯合大劑量組的細胞蛋白/細胞數比值（2.82±0.13）、（2.61±0.12）μg×104呈現出下降趨勢， 差異有統計學意義（P<0.05）。

2. 2 系膜細胞的周期改變情況 將NG組為比較對象， 其他四組經高糖培養48、72 h后， 系膜細胞的增值水平減弱；HG聯合中劑量GSE組和HG聯合大劑量組明顯比HG組要高， 差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1。

2. 3 各組P27和P21蛋白質表達情況 將NG組為對比對象， 其他四組系膜細胞經過D-葡糖連續刺激2 d后， 兩種物質的蛋白質水平顯著提升（P<0.05）。經高糖聯合GSE處理后， 以單獨高糖組為研究對象， 證明GSE可全面對P21和P27起到抑制上升， 濃度存在依賴性， 差異有統計學意義（P<0.05）。見圖2。

2. 4 各組系細胞膜周期變化詳情 將NG為比較對象， 系細胞膜經過高糖連續刺激48 h 后， 細胞G0/G1期的比例顯著上升， 和S期相比顯著減少， 差異有統計學意義（P<0.05）。HG聯合中量GSE組和HG聯合高量GSE組細胞的G0/G1比例下降， S期細胞明顯提升， 差異有統計學意義（P<0.05）。

3 討論

既往研究證實， DN細胞表型轉化的先期特征為細胞異常肥大， 以系膜細胞為顯著， 這種情況和DN后期病理存在較為顯著聯系[2]。由此能夠看出， 對肥大的系細胞膜進行處理， 對于暫緩DN的進展均有十分顯著的現實意義。

GSE有著生理和藥理雙重活性， 目前已經廣泛應用于多種疾病臨床治療中。但值得說明的是， 當前關于GSE保護DN細胞和分子機制方面有待考察。在本次實驗的相關研究結果中能夠看出， 經30 mmol/L刺激之后， 系細胞膜體現出肥大， 且細胞的增殖能力明顯下降， G0/G1細胞的百分數明顯提升， 而S期內的百分數呈現出下降趨勢。值得說明的是， 系細胞膜之所以出現肥大， 其主要原因和利用誘導細胞周期蛋白依賴性酶抑制物表達， 令系細胞膜再一次進入新的細胞周期時無法通過G1到達S期， 進而令細胞出現肥大現象。本次研究的另一項結果證實， 系細胞膜經高糖處理后， P27和P21的表達量明顯提升。葡萄籽提取物呈現為依賴濃度性， 高糖誘導系細胞膜肥大， 進而令細胞總蛋白/細胞數量下降， 提升系細胞膜的增值水平， 令S期細胞比例上調， G0/G1比例下降。推進細胞膜會順利通過G1期， 進而能夠證明， GSE可全面抑制P27和P21的表達， 推進G1期， 對高糖誘導系細胞膜肥大起到拮抗作用。

綜上所述， GSE可全面抑制高糖誘導系細胞膜肥大， 證明該物質能夠全面緩解DN的疾病進展。

參考文獻

[1] 郭卓雨， 高麗萍， 李貞.葡萄籽原花青素對順鉑誘導人胚腎細胞凋亡的拮抗作用.食品科學， 2014（1）：234-238.

[2] 張慶， 楊志勇， 魏令， 等.葡萄籽提取物對人骨肉瘤U2OS細胞抑制作用及機制的研究.華中科技大學學報（醫學版）， 2014（2）： 173-176.

[收稿日期：2016-01-25]