豚鼠分泌性中耳炎鼓室硬化進程

李琰，謝南屏，萬良財，周麗楓，孫昌志廣州市婦女兒童醫療中心耳鼻喉科，廣東廣州500；南方醫科大學珠江醫院耳鼻咽喉科，廣東廣州508

豚鼠分泌性中耳炎鼓室硬化進程

李琰1，謝南屏2，萬良財2，周麗楓1，孫昌志11廣州市婦女兒童醫療中心耳鼻喉科，廣東廣州510120；2南方醫科大學珠江醫院耳鼻咽喉科，廣東廣州510282

目的制作鼓室硬化豚鼠模型，驗證分泌性中耳炎鼓膜置管是鼓室硬化的重要病因。方法選擇健康豚鼠50只，鼓室內注射肺炎鏈球菌液。注射7 d后選取有中耳積液的30只豚鼠，左耳置入鼓膜通氣管，右耳行鼓膜切開作為對照。1個月、3個月、6個月后分別取A、B、C組豚鼠的中耳粘膜，觀察其組織形態變化。結果在制作模型3個月以及更長時間的實驗耳中可出現鼓室硬化病理改變，組織纖維化程度及鈣質沉積與通氣管放置時間成正比。結論鼓膜置管是鼓室硬化重要病因。臨床鼓膜置管手術需謹慎。

鼓室硬化；豚鼠；鼓膜置管

分泌性中耳炎在小兒中較多見，大部分可自愈，少數會進展甚至導致聽力下降。在反復藥物治療失敗情況下需行鼓膜置管手術。鼓膜置管術是臨床治療分泌性中耳炎的常用方法，術后即可明顯改善患者聽力，但許多學者研究表明鼓膜切置管術是導致鼓室硬化的重要病因。Pereira等［1］對75例（150耳）分泌性中耳炎患兒鼓膜切開置管術后隨訪38個月，發現鼓室硬化的發生率為23.3%。有學者將分泌性中耳炎患者鼓膜置管術后并發癥進行薈萃分析，發現有32%患者發生鼓室硬化［2］。為了對鼓室硬化進行早期干預和預防，降低鼓室硬化發病率，我們構建動物模型來進行此方面的實驗研究，期待臨床上對分泌性中耳炎患者發生鼓室硬化進行有效預防。

1　資料與方法

1.1動物及分組

普通級健康豚鼠50只，體質量250～350g，雌雄不拘。入組豚鼠均為電耳鏡檢查光錐清晰，鼓膜完整，排除外耳道、中耳感染。TP注射針向鼓室注射0.1 mL滅活的肺炎鏈球菌液，7 d后選取有鼓室積液的豚鼠30只，將30只豚鼠隨機分為3組，A組造模后1個月、B組造模后3個月、C組造模后6個月。左耳設為實驗組（30耳），右耳設為對照組（30耳）。

1.2主要儀器設備

手術顯微鏡，頭皮針自制的硅膠通氣管。

1.3動物模型

豚鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（35 mg/kg）全麻后，右側臥位，消毒左耳廓及外耳道皮膚，顯微鏡下于鼓膜前下象限切開、放置通氣管。左側臥位，消毒右耳后，鼓膜切開刀于前下象限切開，約1.5 mm。術后1月、2月、3月時，檢查豚鼠，左耳通氣管脫落的進行重新置管。

1.4制作標本

造模1、3、6個月時將對應的該組豚鼠麻醉后處死，暴露聽泡及周圍結構，取出雙側聽泡，電鉆磨開外耳道骨壁，暴露鼓膜和鼓室腔，手術顯微鏡下觀察鼓膜及中耳粘膜，予剝離子剝取中耳粘膜，置入10%甲醛液中固定3 h后取出，石蠟包埋切片，片厚4～6 μm，HE染色，在光學顯微鏡下進行觀察。

1.5統計方法

1.5.1四格表資料的Fisher卡方檢驗采用單側檢驗，檢驗水準α=0.05，用SPSS11.5軟件包進行統計分析。分析實驗組與對照組中鼓室硬化發生的百分率是否有統計學差異。

1.5.2分層計數資料的Fisher卡方檢驗將實驗組按造模時間進行分層，采用單側檢驗，檢驗水準α=0.05，用SPSS11.5軟件包進行統計分析，造模1個月組、造模3個月組、造模6個月組鼓室硬化發生情況。

2　結果

A組有1只豚鼠耳化膿，排除實驗外。

2.1形態學觀察

豚鼠對照耳（n=30）鼓膜均愈合，鼓膜完整，光錐渾濁，未見鈣化斑。A組（n=9），聽泡骨壁增厚，鼓膜通氣管脫落，鼓膜穿孔、渾濁。鼓室內見稀薄分泌物，鼓室粘膜輕度水腫、增厚。光鏡下見：粘膜炎性改變，淋巴細胞浸潤，未見鈣化。B組（n=10），聽泡骨壁進一步增厚，鼓膜增厚，顏色暗，鼓室粘膜水腫較1個月時減輕。3例標本光鏡下見：中耳粘膜上皮下結締組織內見鈣化及玻璃樣變，纖維組織增生。C組（n=10），有4例顯微鏡下見白色鈣化斑，大小約0.2 cm×1.0 cm。4例標本光鏡下見：大量纖維組織增生，鈣化范圍擴大，玻璃樣變物質減少。成骨細胞增生，新生骨組織（圖1）。

2.2統計結果

2.2.1四格表資料Fisher x2檢驗結果單側檢驗的結果：χ2=6.525，v=1，P=0.011（單側），按α=0.05檢驗水準差異有統計學意義，可認為實驗組（鼓膜置管）鼓室硬化的發生率高于對照組鼓室硬化的發生率。說明鼓膜置管的豚鼠鼓室硬化的發生率比正常豚鼠鼓室硬化的發生率高（表1）。

2.2.2分層計數資料的Fisher χ2檢驗結果建立數據文件：以29例實驗耳，30例對照耳，按時間分層，研究鼓膜置管對鼓室硬化發生的影響。以造模時間為分層變量，分別做造模后時間長短與鼓室硬化的相關性檢驗，按α=0.05檢驗水準，結果顯示造模3個月時，造模與鼓室硬化的發生在統計學無相關性，P=0.105（單側），造模6個月時，造模與鼓室硬化的發生存在相關，P=0.043（單側）。說明隨著鼓膜切開置管時間的延長，鼓膜切開置管與鼓室硬化的相關性有增高的趨勢。也就是說隨著鼓膜切開置管術后時間的延長，鼓室硬化發生率有增高趨勢（表1）。

表1　鼓室硬化的實驗結果

3　討論

鼓室硬化是中耳慢性炎癥（包括非化膿性炎癥和化膿性炎癥）或急性感染反復發作而引起中耳粘膜下層和鼓膜固有層的退行性變，發病機制有多種，其中之一與分泌性中耳炎鼓膜置管有關［3］。

本實驗中我們發現置管1月后粘膜下層或固有層出現結締組織增厚，細胞密度增加，未發現鈣質沉積現象，在置管3～6個月標本中，鈣化發生在粘膜下層和內環狀纖維層，鈣化斑沉積程度和置管時間長短成正相關，鈣化程度隨時間延長而增加，組織學變化程度在組間和組內均存在差異。這個過程中鈣化斑形成與人鼓室硬化表現相似，與John等［4］的研究結論一致。通過豚鼠分泌性中耳炎鼓膜置管可以得到鼓室硬化的動物模型，以便進行更深入的研究。

鼓膜置管是分泌性中耳炎常見治療方法。我科就診的兒童分泌性中耳炎患者比較常見，大部分患兒通過保守治療治愈。有些患兒腺樣體肥大、鼻竇炎并發分泌性中耳炎，藥物治療3個月效果欠佳，考慮鼓膜置管手術。我們觀察到術后患者聽力顯著提高，鼓膜置管并發癥也不容忽視，如感染、穿孔、鼓室硬化等。Jassar等［5］通過對置管術后患者進行9年隨訪，發現其中50%患者發生鼓室硬化。Johnston等［6］研究發現兒童分泌性中耳炎置管2年后鼓室硬化發生率為74.7%，未置管患兒鼓室硬化發生率為3.0%。本實驗中置管3個月組鼓室硬化發生率為30%，置管6個月組發生率為40%。通氣管放置的時間越長，發病率越高。

分泌性中耳炎鼓膜置管后發生鼓室硬化有以下因素：置管后鼓室內氧濃度增大，組織與通氣管接觸產生排異反應，置管后鼓膜與通氣管相對固定也是原因之一［7］。大量的氧氣進入中耳，氧自由基增加，激發了纖維化、透明樣變性、凋亡等不可逆損傷，發生鈣質沉著或骨化病變。Karlidag［8］檢測中耳炎患者中耳黏膜標本和血漿中氧化反應指標，發現鼓室硬化組中耳黏膜標本中的一氧化氮、丙二醛活性及血漿中的丙二醛、紅細胞過氧化氫酶活性均顯著高于非鼓室硬化組，說明氧化反應在鼓室硬化發展中起一定作用。中耳通氣管的大小、通氣管的材質，置管時的創傷出血、置管時間、通氣管的杠桿作用質量對鼓膜張力的影響都會影響到鼓膜硬化的發生。Dingle［9］認為，在分泌性中耳炎鼓膜置管術后，通氣管留置時間是影響鼓室硬化發病率的最主要因素，時間越長，發病率越高。切口和鼓室繼發感染也可能會引起鼓室硬化發生［10］，本實驗排除了感染因素。

預防鼓膜硬化很重要，其一旦發生，過程不可逆。目前臨床應用有長效管和短效管。初次置管一般選擇短效管，放置時間3～12個月。二次置管或者有腭裂病史的患兒，可置長效管，放置時間一般2年或以上。根據患兒病情選擇。盡量避免或減少醫源性并發癥發生。置管3～6個月標本中大量纖維組織增生，增生的纖維組織排列紊亂，正常纖維組織走向和超微結構發生歪曲和斷裂。McMin［11］推測細胞重建過程中不能再造出正常纖維走向，鼓室粘膜固有層結構在胚胎發育期已經形成。鼓室硬化的預防工作尤為重要。Wielinga［12］認為早期的再通氣可以使鈣質沉積完全消失但纖維組織的變化是不可逆的。

本實驗中，置管位置選擇鼓膜前下象限，于臨床手術置管位置一致，保證模型相似性。同時，通氣管如置于后部象限可能會損傷圓窗膜或聽骨鏈而引起并發癥。分泌性中耳炎鼓膜置管可以導致鼓室硬化發生，我們期待在臨床工作中進行預防。國外一些專家已經對此進行研究。Uneri等［13-14］通過大鼠實驗發現維生素E涂層的硅膠管可降低鼓室硬化的發生率，并進一步研究72名鼓膜置管兒童，術后9個月發現經維生素E局部治療的右耳僅15.3%發生鼓膜硬化，而未經治療的左耳鼓膜硬化發病率為30.6%。表明鼓室內使用Vit E可以降低鼓室硬化發病率。還有許多學者報道有關抗氧化劑等藥物預防鼓室硬化的動物實驗研究［15］。國內目前還未看到相關實驗，抗氧化劑能否應用于臨床鼓室硬化預防有待進一步實驗明確。

該實驗表明鼓膜置管是鼓室硬化的一個重要病因，豚鼠鼓膜置管模型可以研究鼓室硬化的進程。鼓室硬化過程不可逆，臨床鼓膜置管手術需謹慎。

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The effect of myringotomy with ventilation tube insertion for otitis media in the formation of tympanosclerosis in guinea pigs

LI Yan1，XIE Nanping2，WAN Liangcai2，ZHOU Lifeng1，SUN Changzhi11Department of Otolaryngology，Guangzhou Children's Hospital，Guangzhou 510120，China；2Department of Otolaryngology，Zhujiang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510282，China

Objective To evaluate the role of myringotomy with ventilation tube insertion for otitis media with effusion in the pathogenesis of experimentally induced tympanosclerosis.MethodsFitty guinea pigs were underwent bilaterally tympanocentesis and inoculated with a suspension of Streptococcus pneumoniae to establish the model of tympanosclerosis. After 7 days，30 guinea pigs showed evidence of otitis media with effusion and were chosen to preform the following experiments.The right ears were treated with myringotomy and inserted with ventilation tube，whereas the left ears were conducted myringotomy to serve as the control group.Middle ear membranes were obtained at 1，3 and 6 months after the operation to observe the morphology changes of tympanic membranes and middle ear mucosa.Results The histopathological changes of tympanosclerosis were found in the right ears of the guinea pig models.There was a positive correlation between the duration of ventilation tube insertion and the extent of calcium deposition and fibrosis.Conclusion Myringotomy with ventilation tube insertion may be involved in the formation of tympanosclerosis.The surgical procedure should be considered carefully in clinical scenario.

tympanosclerosis；guinea pig；myringotomy；ventilation tube insertion

2016-02-01

李琰，主治醫師，E-mail：190690926@qq.com