響應面法優化孜然總酚含量測定的工藝條件

王　卓,索菲婭,安秀峰,張　婷,羅靜鶯

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046)

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響應面法優化孜然總酚含量測定的工藝條件

王卓,索菲婭*,安秀峰,張婷,羅靜鶯

(新疆大學生命科學與技術學院,新疆烏魯木齊 830046)

以新疆孜然為原料,采用超聲波輔助浸提法優化孜然總酚提取的工藝條件。采用福林酚法測定總酚含量,在單因素基礎上,考察乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度對孜然總酚含量測定的影響,通過方差分析對提取過程顯著影響含量測定的因素進行統計分析。結果表明,孜然總酚提取的最佳工藝條件為:乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲溫度60 ℃、超聲時間60 min。在該條件下,孜然總酚的實測含量為13.8 mg/g,與預測值相差約4.5%,比回流提取法含量測定提高了139%,說明通過響應面優化可較大提高孜然總酚的測定含量。

孜然,總酚,單因素,響應面分析法

孜然(CurcumincymlinL.),學名枯茗,也叫孜然芹、安息茴香、野茴香,隸屬于傘形科孜然屬,一年生或二年生草本植物。孜然是少數民族用藥,維藥認為孜然具有醒腦通脈、降火平肝等功效,能祛寒除濕,理氣開胃,對消化不良、胃寒疼痛、腎虛便頻均有療效[1-2]。孜然化學成分為多糖類、酚類、烯烴類、黃酮類、萜類等多種成分[3]。植物多酚具有抗氧化、清除自由基、增強免疫力、抗腫瘤和抗病毒等生物活性,對肥胖、高血脂、Ⅱ型糖尿病、癌癥等慢性疾病的預防和控制有積極作用。超聲波具有能耗低、效率高、不破壞有效成分等特點,適合熱敏物質的提取。目前國內外對孜然果實中揮發油的成分和生物活性研究較多[4-9]。對孜然總酚的提取及其相關活性的研究則鮮見報道[10-11]。本實驗以新疆孜然為原料,采用超聲波輔助浸提法對孜然總酚進行提取,優選出超聲波輔助浸提法測定孜然總酚的最佳工藝條件,以期為孜然總酚進一步開發利用提供數據參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

新疆孜然吐魯番,經新疆大學生命科學與技術學院索菲婭副教授鑒定為孜然(CurcumincymlinL.)。

福林酚(Folin&Ciocalteu’s phenol reagent批號YY12202)上海源葉生物科技有限公司;(+)-兒茶素對照品(批號YY90158)上海源葉生物科技有限公司。

Spectrumlab53紫外可見分光光度計上海棱光技術有限公司;KQ-250DE型數控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司;AL104分析天平北京賽利多斯儀器系統有限公司;酶標儀Benchmark plus,BIO-RAD,上海第三分析儀器廠。DG160C型中藥材粉碎機浙江春海藥材器械廠;循環水式真空泵鞏義予華儀器有限責任公司;CCA-1100型旋轉蒸發儀東京理化器械株式會社。

1.2實驗方法

1.2.1樣品溶液的制備準確稱取干燥孜然粉1.00 g,置于100 mL具塞錐形瓶中,加入不同乙醇濃度在不同溫度下超聲提取規定時間,抽濾定容至100 mL,即得。

1.2.2總酚含量測定采用Folin-Ciocalteu法[12]改進為:移取提取液0.5 mL,加入5 mL的稀釋10 倍Folin-Ciocalteu試劑,搖勻后,靜置反應5 min,再加入7.5%的Na2CO3溶液4 mL,加入1.5 mL蒸餾水至反應體系為11 mL,搖勻,室溫放置60 min,在波長725 nm處測定吸光度。采用(+)-兒茶素為對照品,獲得(+)-兒茶素的標準曲線,根據標準曲線算出孜然提取液總酚的質量濃度,以(+)-兒茶素當量表示,單位為mg/g?？偡犹崛×?mg/g)=C×V×n/M,式中:C為(+)-兒茶素的質量濃度(mg/mL);V為溶液體積(mL);n為稀釋倍數;M為取樣量(g)。

1.2.3單因素實驗采用超聲波輔助提取,考察乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率、粒度對總酚提取含量測定的影響。通過固定上述任意五個影響因素的值,變化單一影響因素考證其對孜然總酚提取量的影響。固定值分別為乙醇濃度60%、料液比1∶10、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W、粒度60目。

考察乙醇濃度對孜然總酚含量測定的影響,固定料液比1∶10、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W、粒度60目,在乙醇濃度分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%的條件下進行提取含量測定。

考察料液比對孜然總酚含量測定的影響,固定乙醇濃度60%、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W、粒度60目,在料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30的條件下進行提取含量測定。

考察超聲溫度對孜然總酚含量測定的影響,固定料液比1∶10、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W、粒度60目,在超聲溫度分別為20、30、40、50、60、70 ℃的條件下進行提取含量測定。

考察超聲時間對孜然總酚含量測定的影響,固定乙醇濃度60%、料液比1∶10、超聲溫度40 ℃、超聲功率200 W、粒度60目,在超聲時間分別為10、20、30、40、50、60 min的條件下進行提取含量測定。

考察超聲功率對孜然總酚含量測定的影響,固定乙醇濃度60%、料液比1∶10、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、粒度60目,在超聲功率分別為100、150、200、250 W的條件下進行提取含量測定。

考察粒度對孜然總酚含量測定的影響,固定乙醇濃度60%、料液比1∶10、超聲溫度40 ℃、超聲時間30 min、超聲功率200 W,在分別過60、70、90、100目篩的情況下進行提取含量測定。

在到達最大灌漿速率時間（Tmax）方面，外緣籽粒達到最大灌漿速率的時間為16～20 d，中部部籽粒在 20～22 d，而內部籽粒在 22～27 d，表明外緣籽粒的灌漿速度快，內部籽粒較慢；其中在深松45 cm（S45），密度D1時外緣籽粒達到最大灌漿速率的時間最短為16.11 d。不同粒位向日葵的灌漿速率最大時的籽粒重（Wmax），灌漿速率最大時的籽粒重占最終籽粒重的百分率（I）均表現為外緣籽粒＞中部籽粒＞內部籽粒，其中外緣籽粒Wmax和I在S45，密度為D1時最大，分別為5.543 g/（?！），62.53%。

每組實驗設置三個平行,測定結果取平均值,實驗數據采用GraphPad Prism5.01處理。

1.2.4響應面實驗設計根據Box-Behnken實驗設計原理,選取乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲溫度4個因素為考察對象,總酚提取量為響應值,研究各自變量及其交互作用對孜然總酚提取量的影響,建立預測模型并獲取最佳工藝參數。實驗水平分析表見表1。

表1　響應面實驗設計因素與水平

2　結果與分析

2.1單因素實驗結果與分析

圖1中A,隨著乙醇濃度的增大,孜然總酚的提取量呈現先增加后減少的趨勢。當乙醇濃度為60%時,孜然總酚的提取量達到最高值,此后隨著乙醇濃度的增大,總酚提取量逐漸降低,這是因為隨著乙醇濃度的增加,總酚類物質在乙醇溶液中的溶解度增加,當乙醇濃度達到60%以后,溶液極性增強,溶劑與總酚極性的相似程度降低,導致總酚物質的溶解度下降。因此最佳乙醇濃度選擇為60%。

圖1　乙醇濃度(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)、超聲時間(D)、超聲功率(E)及粒度(F)對總酚含量的影響Fig.1　Effects of ethanol concentration(A),solid/liquid ratio(B),ultrasonic temperature(C),ultrasonic time(D),ultrasound power(E)and granularity on the extraction yield of polyphenol from Curcumin cymlin L.

圖1中B,隨著料液比的增大,孜然總酚的提取量也隨之增加,這是由于當樣品量一定時,增加溶劑的量可以降低樣品顆粒周圍有效成分的濃度,從而增加原料與有機溶劑接觸面的濃度差,提高了總酚向溶劑的擴散速度,更有利于總酚的溶出。當料液比超過1∶10后,總酚的提取量逐漸減少,這是由于隨著料液比的不斷增加,提取液總酚濃度降低,總酚類物質溶出速度減慢,導致提取量減少。

圖1中C,超聲溫度在20～40 ℃時,隨著超聲溫度的升高,孜然總酚提取量呈上升趨勢。當超聲溫度為40 ℃時,總酚的提取量達到最高值,此后,總酚提取量隨超聲溫度的升高呈下降趨勢。這是因為溫度升高,溶劑的表面張力系數及粘滯系數下降,蒸汽壓增大,超聲空化閾值下降,有利于空化泡的產生,但蒸汽壓增加,又會導致空化強度或空化效應下降,從而不利于提取過程的強化,過高的溫度還可使總酚自身氧化。由此得出:40 ℃為較優的超聲提取溫度。

圖1中D,超聲時間對孜然總酚提取量有一定的影響,當超聲時間10～30 min范圍時,隨著超聲波處理時間的延長,孜然總酚提取量呈上升趨勢。當超聲時間超過30 min后,孜然總酚提取量開始下降。這是因為超聲波對細胞壁有破壞作用,隨著提取時間的延長,破壞作用程度加大,溶出物增多,提取量相應提高;繼續延長超聲處理時間,由于總酚類物質的結果被破壞,導致提取量下降。由此得出:30 min為超聲處理的最佳時間。

圖1中F,隨著粒度的減小,孜然總酚提取量不斷下降。這是由于隨著孜然粒度的下降,顆粒中油性成分含量很高,限制了總酚的提取。由此得出:選擇孜然粉碎后,過60目篩為總酚提取的最佳粒度。

在響應面實驗設計因素的選取上,考慮到粒度對孜然總酚提取液含量測定影響明顯,選擇單因素測定總酚含量最高的60目為固定值,另外本實驗室數控超聲波清洗器最大輸出功率為250 W,考慮到長時間多組實驗對儀器的耗損,選擇單因素測定總酚含量較高時的超聲功率200 W為固定值,考察不同乙醇濃度、料液比、超聲溫度、超聲時間對孜然總酚含量測定的影響。

2.2響應面實驗結果與分析

由表3可知,該回歸模型p<0.0001,表明回歸模型達到極顯著水平,而失擬項p=0.07>0.05,表明差異不顯著,說明殘差均由隨機誤差引起,未知因素對實驗結果干擾小,方程對實驗擬合較好。根據F值可知,影響因子的主效應主次順序為:超聲溫度(X3)>乙醇濃度(X1)>超聲時間(X4)>料液比(X2)。

2.3建立模型方程與顯著性檢驗

利用Design-Export V8.0.6.1統計軟件對表2中的實驗數據進行回歸擬合,得到孜然總酚提取量(Y)與乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、超聲溫度(X3)、超聲時間(X4)的二次多項回歸模型為:

Y=11.22+1.76X1+1.06X2+1.79X3+1.27X4+0.36X1X2+0.38X1X3-0.5X1X4+0.67X2X3+0.48X2X4+0.27X3X4+0.13X12+0.056X22-0.47X32+0.65X42。該回歸方程的決定系數R=0.9660,說明該模型擬合良好。

2.4響應面圖與結果分析

圖2為各因素交互作用對孜然總酚得率的響應面,反映了自變量X1、X2、X3、X44個因素任意兩個自變量取零水平時,其他兩個因素的交互作用對孜然總酚提取量的影響情況。比較各圖表可知:乙醇濃度和超聲溫度的曲線相對較陡,說明乙醇濃度和超聲溫度對孜然總酚提取量的影響較為顯著。而料液比的曲線平緩,響應值較小,說明料液比對孜然總酚提取量的影響不顯著。由圖2中等高線可看出乙醇濃度與超聲時間、乙醇濃度與超聲溫度、超聲時間與超聲溫度的交互作用較強,對孜然總酚提取量的影響顯著。由圖可看出乙醇濃度與料液比、超聲時間與料液比、超聲溫度與料液比交互作用較弱,對孜然總酚提取量的影響不顯著[13]。

表2　響應面實驗結果

表3　回歸方程的方差分析

注：**表示極顯著(p<0.01)。

2.5最優條件的確定及驗證實驗

根據回歸模型通過Design-Export V8.0.6.1軟件對實驗結果進行分析處理,得到超聲輔助提取孜然總酚的最優條件為:乙醇濃度69.97%、料液比1∶20、超聲溫度60 ℃、超聲時間60 min,在此條件下,模型預測的最大總酚提取量為13.2 mg/g?？紤]到實際操作的局限性,各因素分別取整,修正為:乙醇濃度70%、料液比1∶20、超聲溫度60 ℃、超聲時間60 min。在此條件下進行3次驗證實驗,孜然總酚提取量的平均值為13.8 mg/g,與預測值相差4.5%。

回流提取法獲得孜然總酚[10],含量測定最高為5.77 mg/g,對比超聲輔助最佳條件下孜然總酚含量測定,后者比回流提取法測定含量提高139%。

圖2　乙醇濃度(A)與料液比(B)、乙醇濃度(A)與超聲時間(C)、乙醇濃度(A)與超聲溫度(D)、料液比(B)與超聲時間(C)、料液比(B)與超聲溫度(D)、超聲時間(C)和超聲溫度(D)對總酚提取量的影響Fig.2　Response surface plot showing the effects of Ethanol concentration and Solid/liquid ratio,Ethanol concentrationand Ultrasonic time,Ethanol concentration and Ultrasonic temperature,Solid/liquid ratio and Ultrasonic time,Solid/liquid ratio and Ultrasonic temperature,Ultrasonic time and Ultrasonic temperature on extraction yield of polyphenols from Curcumin cymlin L.

3　結論

利用響應面實驗設計優化了孜然總酚的提取工藝,建立其多元二次優化模型方程,結果顯示乙醇濃度、超聲溫度對孜然總酚含量測定均有極顯著的影響(p<0.01)。孜然總酚超聲輔助提取工藝參數與提取量的數學模型回歸顯著,擬合程度較好,能夠應用于孜然中總酚的回歸分析和參數優化。優化后孜然總酚含量測定顯著提高,可為進一步研究孜然總酚提供數據支持。

[1]謝喜國,阿布力米提·伊力,阿吉艾克拜爾·艾薩.維吾爾醫藥用植物孜然化學成分研究[J].中成藥,2011,33(11):1939-1941.

[2]劉勇民.維吾爾藥志(上冊)[M].烏魯木齊:新疆科技衛生出版社,1999. 247-249.

[3]Sowbhagya H B,Suma P F,Mahadevamma S,et al. Spent residue from cumin-a potential source of dietary fiber[J]. Food Chemistry,2007,104(3):1220-1225.

[4]Li X M,Tian S L,Pang Z C,et al. Extraction of Cuminum cyminum essential oil by combination technology of organic solvent with low boiling point and steam distillation[J]. Food Chemistry,2009,115(3):1114-1119.

[5]Lu W,ZiMing W,HuiHui Z,et al. Ultrasonic nebulization extraction coupled with headspace single drop microextraction and gas chromatography-mass spectrometry for analysis of the essential oil in Cuminum cyminum L[J]. Analytica Chimica Acta,2009,647(1):72-77.

[6]Bettaieb I,Bourgou S,Wannes W A,et al. Essential Oils,Phenolics,and Antioxidant Activities of Different Parts of Cumin(Cuminum cyminum L.)[J]. J. Agric. Food Chem,2010,58(19):10410-10418.

[7]裴貴珍,陳文,馬世俊,等.孜然揮發油β-環糊精包合物的制備與評價[J].中成藥,2015,37(2):416-419.

[8]盧帥,索菲婭,王傲立,等.新疆孜然黃酮超聲提取及其抗氧化作用研究[J].中國農學通報,2013,29(27):215-220.

[9]Allahghadri T,Rasooli I,Owlia P,et al. Antimicrobial Property,Antioxidant Capacity,and Cytotoxicity of Essential Oil from Cumin Produced in Iran[J]. Journal of Food Science,2010,75(2):H54-H61.

[10]王強,劉玲玲,唐軍,等.新疆產孜然抗氧化活性研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(16):138-141.

[11]Ani V,Naidu K A. Antihyperglycemic activity of polyphenolic components of black/bitter cumin Centratherum anthelminticum

(L.)Kuntze seeds[J]. European Food Research and Technology,2008,226(4):897-903.

[12]Duan X J,Zhang W W,Li X M,et al. Evaluation of antioxidant property of extract and fractions obtained from a red alga,Polysiphonia urceolata[J]. Food chemistry,2006,95(1):37-43.

[13]Zhao Q,Kennedy J F,Wang X,et al. Optimization of ultrasonic circulating extraction of polysaccharides from Asparagus officinalis using response surface methodology[J]. Int J Biol Macromol,2011,49(2):181-187.

Content determination of polyphenol fromCurcumincymlinL. using response surface method

WANG Zhuo,SUO Fei-ya*,AN Xiu-feng,ZHANG Ting,LUO Jing-ying

(College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046,China)

The polyphenol from XinjiangCurcumincymlinL. was abstracted by ultrasonic-assisted extraction,and the extraction yield was measured by Lowry method with Folin phenol.According to single-factor test,the extraction yield was determined by the method of response surface analysis(RSA)with four factors(the ethanol concentration,solid/liquid ratio,ultrasonic time and ultrasonic temperature),And the notability difference was analyzed with the statistic method of ANOVA. Results showed that the optimal conditions were as follows:ethanol concentration 70%,solid/liquid ratio1∶20,ultrasonic time 60 min,ultrasonic temperature60 ℃.Under such conditions,the actual amount of polyphenols extracted for 13.8 mg/g,with a difference of 4.5% compared with predictive value,this method of extracting higher than 139% with reflux extraction.Optimization of Using Response Surface Methodology can greatly improve the content determination of polyphenols from XinjiangCurcumincymlinL.

CurcumincymlinL.;polyphenol;single factor;response surface analysis

2015-11-16

王卓(1990-),男,在讀碩士研究生,主要從事藥用植物資源研究工作,E-mail:869385044@qq.com。

索菲婭(1964-),女,碩士,副教授,主要從事植物資源、植物化學和新藥的研發工作,E-mail:2576931152@qq.com。

國家自然科學基金項目(31160073);新疆維吾爾自治區科技廳支疆項目(N0.201091245)經費支持。

TS255.1

B

1002-0306(2016)11-0195-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.11.032