冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ深層發酵條件的優化

盛嘉俊，陳曉光，葉克難*

（中山大學生命科學學院，廣東廣州510275）

冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ深層發酵條件的優化

盛嘉俊，陳曉光，葉克難*

（中山大學生命科學學院，廣東廣州510275）

以菌絲體干質量為評價指標，對冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis）CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中的發酵條件進行優化。在單因素試驗基礎上，選取攪拌轉速、通氣量和裝料系數，采用3因素3水平的正交設計試驗，得出最佳發酵條件并驗證，最后擴大至20 L發酵罐。結果表明，冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中培養6 d的最佳發酵條件為攪拌轉速220 r/m in、通氣量2.0 vvm和裝料系數60%，在此條件下進行驗證試驗，菌絲體干質量能達到（19.85±0.52）g/L。擴大至20 L發酵罐，可得菌絲體干質量為（16.78±0.06）g/L，發酵結果能達到5 L發酵罐的85%。通過比較搖床與5 L發酵罐的生長曲線，發現pH值能反映菌絲體干質量的變化趨勢，可將pH值的變化規律作為發酵結束的判斷依據。

冬蟲夏草菌；深層發酵；菌絲體；發酵條件；優化

冬蟲夏草是由冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis（Berk.）Sacc.）侵染蝙蝠蛾科（Hepialidae）幼蟲而形成的僵蟲與子座的結合體，分布在我國西藏、青海、云南、四川等海拔3 000～5 000 m的高寒地帶中。冬蟲夏草具有多種藥理功效，如抗腫瘤［1］、抗氧化［2］、降血糖［3］、調節免疫［4］等?！吨袊幍洹罚?010年版）對其的描述是“補腎益肺，止血化痰。用于腎虛精虧，陽痿遺精，腰膝酸痛，久咳虛喘，勞嗽咯血”［5］。因此國內外對其需求量不斷增加，但受生長環境的制約，天然蟲草產量有限，加之過度采挖，導致其產量逐年下降，遠遠低于市場需求。1948年HUMFELD H等［6］首次利用液體發酵技術成功獲得蘑菇菌絲體后，在藥食用真菌人工培育方面，液體深層培養技術憑借原料來源廣泛、生長快速、生產周期短、工業化生產和產生的活性物質多等優勢，逐漸得到了廣泛的應用［7］。在冬蟲夏草的人工培育中，利用其無性型的發酵產物來代替天然冬蟲夏草的研究已經取得了較為理想的結果，且深層發酵獲得的菌絲體與野生冬蟲夏草有相似的化學成分［8］。

吳彩琴等［9］以菌絲體干質量和多糖含量為評價指標，在1 L的錐形瓶中得出了冬蟲夏草菌的培養最適條件；王祖華等［10］通過搖床培養獲得了冬蟲夏草菌最適培養基配方；趙潤等［11］以菌絲體生物量為衡量指標，獲得了冬蟲夏草菌液體最適培養基配方。大部分僅僅采用搖瓶培養，只是獲得了搖床最佳培養工藝和培養基配方，不足以開展更大規模的生產，故有必要對冬蟲夏草菌在發酵罐的培養條件進一步優化。

本研究采用單因素試驗和正交設計試驗優化冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐的發酵條件，以獲取最大量的菌絲體干質量，實現從搖床至5 L發酵罐的擴大培養，最后擴大培養至20 L發酵罐，以期為冬蟲夏草菌深層發酵的工業化生產和應用提供必要的依據。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

冬蟲夏草菌（Cordyceps sinensis）CS.SYSU-Ⅱ：中山大學生命科學學院真菌生物技術實驗室提供。

1.1.2主要試劑

葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸：廣州化學試劑廠；細菌學蛋白胨：廣東環凱生物科技有限公司；鹽酸硫胺：上海源聚生物科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸：國藥集團化學試劑有限公司；甲醛：廣東光華科技股份有限公司；氫氧化鈉：廣東汕頭市西隴化工廠。所有試劑均為分析純。

1.1.3培養基

斜面培養基：馬鈴薯（去皮）200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，瓊脂20.0 g/L，pH值自然。

種子培養基：馬鈴薯（去皮）200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，KH2PO43.0 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，pH值自然。

發酵培養基：葡萄糖40.84 g/L，蛋白胨21.55 g/L，KH2PO43.00 g/L，MgSO4·7H2O 1.50 g/L，VB10.08 g/L，初始pH值6.5。

1.2儀器與設備

ZHWY-211B恒溫培養振蕩器：上海智誠分析儀器制造有限公司；LXJ-ⅡC低速大容量離心機：上海安亭科學儀器廠；ES-150精密鼓風干燥箱：施都凱儀器設備（上海）有限公司；HHS電熱恒溫水浴鍋：上海博迅實業有限公司醫療設備廠；754紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司；5 L全自動發酵罐：德國賽多利斯集團；20 L發酵罐：上海高機生物工程有限公司。

1.3方法

1.3.1菌種活化

將冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ菌種接種于斜面培養基上，于25℃培養5～6 d后，置于4℃冰箱內保存，每隔3個月轉種一次。

1.3.2液體種子培養

利用接種環取8環斜面菌種，接入裝液量為100 m L/500m L液體培養基中，于24℃、140 r/m in培養3 d。

1.3.3搖床培養［12］

裝液量100 m L/500 m L，接種量3%，培養溫度24℃，搖床轉速140 r/m in。

1.3.45 L發酵罐培養

裝料系數60%，接種量3%，培養溫度24℃，通氣量1.0 vvm，攪拌轉速140 r/min，消泡劑0.1%，裝配有pH和溶氧（dissolved oxygen，DO）電極。

1.3.55 L發酵罐發酵條件優化前生長曲線

利用1.3.4中的培養條件繪制出5 L發酵罐優化前的生長曲線，確定統一的培養時間以保證單因素試驗和正交設計試驗時各個試驗因素水平間的培養時間是一致的。

1.3.65 L發酵罐發酵條件的單因素試驗

以菌絲體干質量為評價指標，選取攪拌轉速、通氣量和裝料系數3個因素，各試驗因素水平分別為攪拌轉速（A）：100 r/m in、140 r/min、180 r/min、220 r/min、260 r/min；通氣量（B）：0.4vvm、0.8vvm、1.2vvm、1.6vvm、2.0vvm；裝料系數（C）：50%、60%、70%、80%。每個試驗因素水平平行試驗兩次。

1.3.75 L發酵罐發酵條件的正交設計試驗

在單因素試驗的基礎上結合正交設計原理［13］，以菌絲體干質量為評價指標，對攪拌轉速、通氣量和裝料系數進行正交設計以確定5 L發酵罐培養最佳發酵條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1　發酵條件優化正交試驗因素與水平Tab le 1 Factors and levels of orthogonal tests for fermentation conditions optim ization

1.3.820 L發酵罐擴大培養［14-15］

由于冬蟲夏草菌是一種絲狀真菌，進行發酵時細胞受攪拌剪切的影響較明顯，而決定攪拌剪切強度的關鍵是攪拌葉尖線速度，若僅僅考慮體積傳遞氧系數或單位體積攪拌功率相等卻不考慮剪切力的影響，可能會導致擴大培養失敗，因此以攪拌葉尖線速度相等為基準，進行從5 L至20 L的發酵擴大培養。其他培養條件保持不變。攪拌葉尖線速度計算公式如下：

式中：γ為攪拌葉尖線速度，m/min；Di：攪拌葉輪直徑，m；N為攪拌轉速，r/m in。

5 L發酵罐的攪拌葉輪直徑為62 mm，20 L發酵罐的攪拌葉輪直徑為79 mm。

1.3.9分析檢測

菌絲體干質量測定：取一定量發酵液以3 000 r/min離心15 m in，收集沉淀后用蒸餾水重復洗滌3次，最后60℃烘干至恒質量，所得即為菌絲體干質量；總糖、還原糖含量測定：總糖含量測定采用苯酚-硫酸法［16］，還原糖含量測定采用3，5-二硝基水楊酸法（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）［17］；氨基酸態氮測定：甲醛滴定法［18］；pH值測定：發酵罐培養在線測定，搖床培養用pH計測定；溶氧值測定：發酵罐培養在線測定。

2　結果與分析

2.15 L發酵罐培養工藝優化前生長曲線

以裝料系數60%，接種量3%，培養溫度24℃，通氣量1.0 vvm，攪拌轉速140 r/min，消泡劑0.1%為發酵條件在5 L發酵罐進行發酵，并按1.3.9進行分析檢測，繪制出5 L發酵罐優化前的生長曲線，通過對生長曲線分析確定適宜培養時間，結果見圖1。

圖1　5 L發酵罐優化前生長曲線Fig.1 G row th curves of mycelia culture in 5 L ferm enter before optimization

由圖1可知，隨著培養時間的延長，pH、總糖含量和還原糖含量都呈現下降趨勢；溶氧在培養1 d后就降至15%以下，且在之后的培養中都維持在低水平；氨基酸態氮在培養過程中的趨勢為先降低再上升，在7 d后回升幅度顯著，可能是菌絲生長變得緩慢，對氨基酸態氮的利用減少；菌絲體干質量在一定范圍的培養時間內與時間呈正相關，但在8 d后增幅趨于緩慢。培養時間太短，則菌絲體干質量低；太長，則菌絲體出現老化，因而都不利于后續試驗開展。綜合考慮，5 L罐發酵時的培養時間確定為6 d。

2.25 L發酵罐培養工藝的單因素試驗結果與分析

2.2.1不同攪拌轉速對菌絲體干質量的影響

固定通氣量1.2 vvm和裝料系數60%，攪拌轉速分別為100 r/min、140 r/min、180 r/min、220 r/min、260 r/min，在溫度24℃條件下發酵培養6 d。從第3天開始取樣，觀察菌絲體干質量在培養過程中的變化，結果見圖2。

圖2　不同攪拌轉速對菌絲體干質量的影響Fig.2 Effect of different stirring speed on dry mass o f mycelia

由圖2可知，隨著培養時間的增加，不同攪拌轉速條件下的菌絲體干質量也隨之增加。當攪拌轉速在100～220 r/m in內，菌絲體干質量隨著攪拌轉速的增加而增加，其中攪拌轉速為220 r/min時，在3～6d的培養時間內，菌絲體干質量幾乎都是最高的，第6天的菌絲體干質量為17.967 g/L；但攪拌轉速為180 r/m in，菌絲體干質量隨著培養時間的延長，增幅較其他攪拌轉速大，第6天的菌絲體干質量也達到了18.133 g/L。當攪拌轉速提高至260 r/min時，從各個培養時間上可以看出，菌絲體干質量有所下降，可能是因為高攪拌轉速條件下，剪切力較大，且絲狀真菌對剪切力較敏感，導致菌絲被打斷，造成了細胞損傷，不利于菌絲的生長。綜上所述，選擇攪拌轉速140 r/m in、180 r/m in、220 r/m in進行正交試驗。

2.2.2不同通氣量對菌絲體干質量的影響

固定攪拌轉速140 r/m in和裝料系數60%，通氣量分別為0.4 vvm、0.8 vvm、1.2 vvm、1.6 vvm、2.0 vvm，在溫度24℃條件下發酵培養6 d。從第3天開始取樣，觀察菌絲體干質量在培養過程中的變化，結果見圖3。

圖3　不同通氣量對菌絲體干質量的影響Fig.3 Effect of different aeration rate on dry mass of mycelia

由圖3可知，提高通氣量，菌絲體干質量也相應增加。當通氣量為0.4 vvm、0.8 vvm、1.2 vvm、1.6 vvm、2.0 vvm時，培養6 d，最大菌絲體干質量分別為7.950 g/L、9.600 g/L、12.717 g/L、13.617 g/L、14.150 g/L，說明較高的通氣量更有利于菌絲的生長。因此選擇通氣量1.2 vvm、1.6 vvm、2.0 vvm進行正交試驗。

2.2.3不同裝料系數對菌絲體干質量的影響

固定攪拌轉速140 r/m in和通氣量1.2 vvm，裝料系數分別為50%、60%、70%、80%，在溫度24℃條件下發酵培養6d。從第3天開始取樣，觀察菌絲體干質量在培養過程中的變化，結果見圖4。

裝料系數是影響溶氧的一個重要因素。由圖4可知，當培養時間延長時，菌絲體干質量也隨之增加。相比裝料系數50%，60%、70%和80%獲得的菌絲體干質量更多，可能是因為裝料系數低導致液體培養基中的溶氧不高。在培養6 d后，裝料系數60%、70%、80%分別能得到菌絲體干質量10.967 g/L、11.217 g/L、10.967 g/L，差異不大，可能原因是三者體積相差太小。綜合考慮選擇裝料系數60%、70%和80%進行正交試驗。

圖4　不同裝料系數對菌絲體干質量的影響Fig．4 Effects o f different volume charge coefficient on dry mass of mycelia

2.35 L發酵罐發酵條件的正交試驗結果與分析

在單因素試驗基礎上，以菌絲體干質量為評價指標，以攪拌轉速、通氣量和裝料系數為評價因素進行正交試驗，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for fermentation conditions op timization

由表2可知，在冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ的5 L發酵罐培養中，影響菌絲體干質量的3個因素的大小次序為A＞B＞C，即在試驗確定的因素中，攪拌轉速的影響最大，通氣量次之，裝料系數的影響最小。通過直觀分析，得出冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中的最優發酵條件組合為A3B3C1，即攪拌轉速220 r/m in，通氣量2.0 vvm，裝料系數60%。在此最佳發酵條件下進行驗證試驗，得到的菌絲體干質量為（19.850±0.519）g/L。

表3　影響菌絲體干質量正交試驗結果各因素顯著性分析Table 3 Significant analysis of various factors of orthogonal tests results on dry mass of m ycelia

由表3可知，攪拌轉速的F值大于F0.01，差異極顯著（P＜0.01），說明攪拌轉速對冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中的生長有極顯著的影響；通氣量的F值大于F0.05水平，差異顯著（P＜0.05），說明通氣量對冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中的生長有顯著的影響，而裝料系數的F值小于F0.05水平，差異不顯著（P＞0.05），說明裝料系數對冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中的生長無明顯的影響。

2.4搖床培養與5 L發酵罐生長曲線比較

搖床培養條件：裝液量100 m L/500 m L，接種量3%，培養溫度24℃，搖床轉速140 r/min；5 L發酵罐培養條件：攪拌轉速220 r/m in，通氣量2.0 vvm，裝料系數60%，接種量3%，培養溫度24℃。各參數按1.3.9進行分析檢測，繪制出搖床與5 L發酵罐培養的生長曲線，結果見圖5。

圖5　搖床（A）及5 L發酵罐（B）培養的生長曲線Fig．5 Grow th curves of m ycelia culture in shaker（A）and 5 L fermenter（B）

由圖5可知，搖床培養和發酵罐培養的pH隨著培養時間的增加，趨勢都是先降低再回升。pH出現下降的原因可能是培養基中的NH4+被利用后產生了H+，也可能是產生了有機酸。當pH回升后，菌絲體干質量的增幅減慢，說明菌體生長開始從對數期轉向穩定期；兩者的菌絲體干質量都隨著培養時間的延長，呈現不斷增加的趨勢，在pH回升的第一天，搖床培養和發酵罐培養的菌絲體干質量都達到最大，分別為（23.633±0.256）g/L和（21.583±0.351）g/L，表明菌絲體干質量變化并不是完全同步于pH，而是遲于pH的改變，因此pH值的變化規律可作為冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ培養結束的判斷依據，與杜巍等［19-20］報道的一致；在總糖含量和還原糖含量變化方面，搖床培養和發酵罐培養都隨培養時間的延長呈現下降趨勢，并在培養后期趨于穩定；搖床培養和發酵罐培養中的氨基酸態氮含量的變化都是先下降再上升，在培養中期含量低，后期出現回升。由此可以說明從搖床放大至5 L發酵罐的優化條件是正確的。

2.520 L發酵罐擴大培養

經計算，20 L發酵罐的攪拌轉速為173 r/m in。通氣量2.0 vvm，裝料系數60%，培養6 d，可得菌絲體干質量為（16.783±0.058）g/L，發酵結果能達到5L發酵罐的85%，表明發酵過程較成功。

3　結論

通過對攪拌轉速、通氣量和裝料系數進行單因素試驗和正交設計試驗，發現攪拌轉速對冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ的影響最大，通氣量次之，裝料系數的影響最小，并得出了冬蟲夏草菌CS.SYSU-Ⅱ在5 L發酵罐中培養6 d的最適發酵條件為攪拌轉速220 r/m in，通氣量2.0 vvm，裝料系數60%，在此條件下進行驗證試驗，能得到菌絲體干質量（19.850±0.519）g/L。在20 L發酵罐上進行擴大培養，可得菌絲體干質量（16.783±0.058）g/L，發酵結果能達到5 L發酵罐的85%。比較搖床培養和發酵罐培養的生長曲線，pH都隨著培養時間的延長，先降低再回升，且pH值能反映菌絲體干質量的變化趨勢，因而pH值的變化規律可以作為培養結束的判斷依據。

［1］ZHANG W，YANG J，CHEN J，et al.Immunomodulatory and antitumour effects of an exopolysaccharide fraction from cultivated Cordyceps sinensis（Chinese caterpillar fungus）on tumour-bearing mice［J］.Biotechnol App l Biochem，2005，42（1）：9-15.

［2］LEUNG P H，ZHAO S，HO K P，et al.Chemical properties and antioxidant activity of exopolysaccharides from mycelial culture of Cordyceps sinensis fungus Cs-HK1［J］.Food Chem，2009，114（4）：1251-1256.

［3］LI S P，ZHANG G H，ZENG Q，et al.Hypoglycem ic activity of polysaccharide，w ith antioxidation，isolated from cultured Cordyceps mycelia［J］. Phytomedicine，2006，13（6）：428-433.

［4］KOH J H，YU K W，SUH H J，et al.Activation of macrophages and the intestinal immune system by an orally adm inistered decoction from cultured mycelia of Cordyceps sinensis［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2002，66（2）：407-411.

［5］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（第一部）［M］.北京：化學工業出版社，2010.

［6］HUMFELD H.The production of mushroom mycelium（Agaricus campestris）in submerged culture［J］.Science，1948，107（107）：373-373.

［7］趙永勛.食藥用菌液體發酵的現狀和展望［J］.農業與技術，2004，24（3）：111-114.

［8］LEUNG P，ZHANG Q，WU J.M ycelium cultivation，chem ical composition and antitumour activity of a Tolypocladium sp.fungus isolated from w ild Cordyceps sinensis［J］.J Appl M icrobiol，2006，101（2）：275-283.

［9］吳彩琴，陳野，郝迎.冬蟲夏草液體發酵生產多糖和菌絲體的研究［J］.食品科學，2009，30（5）：171-174.

［10］王祖華，張柯，李永程.冬蟲夏草菌種的制備及液體培養基的優化研究［J］.洛陽理工學院學報：自然科學版，2010，20（4）：10-12.

［11］趙潤，郭成金.冬蟲夏草菌絲體液體培養基的優化［J］.天津師范大學學報：自然科學版，2008，28（1）：8-11.

［12］羅園香，盛嘉俊，葉克難.一株冬蟲夏草菌的液態發酵條件研究［J］.中國釀造，2015，34（4）：78-81.

［13］劉振學，王力.實驗設計與數據處理［M］.北京：化學工業出版社，2015.

［14］梁世中，朱明軍.生物反應工程與設備［M］.廣州：華南理工大學出版社，2011.

［15］TANG Y J，ZHONG J J.Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid［J］.Enzym e M icrob ial Tech，2003，32（2）：478-484.

［16］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 15672—2009食用菌中總糖含量的測定［S］.北京：中國標準出版社，2009.

［17］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 23881—2009飼用纖維素酶活性的測定濾紙法［S］.北京：中國標準出版社，2009.

［18］中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會.GB/T 5009.39—2003醬油衛生標準的分析方法［S］.北京：中國標準出版社，2003.

［19］杜巍，華澤釗.灰樹花的深層培養工藝及其影響因素的研究［J］.農業工程學報，2004，20（2）：231-234.

［20］王利火，沈家驤，葛珠福.食用真菌工業深層發酵研究［J］.食品與發酵工業，1988，14（4）：51-55.

Optimization of submerged fermentation conditions of Cordyceps sinensis CS.SYSU-Ⅱ

SHENG Jiajun，CHEN Xiaoguang，YE Kenan*
（College of Life Science，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China）

Using the dry mass of m ycelia as evaluation index，the fermentation conditions of Cordyceps sinensis CS.SYSU-Ⅱin 5 L fermenter were optim ized.Based on single factor experiments，stirring speed，aeration rate and volume charge coefficient were selected.The optimum fermentation conditions were determined by 3 factors and 3 levels orthogonal experiments，then verified，and finally extended to 20 L fermenter.The results showed that the optimum conditions of C.sinensis CS.SYSU-Ⅱin 5 L fermenter fermented for 6 d were stirring speed 220 r/m in，aeration rate 2.0 vvm and volume charge coefficient 60%.Under the conditions，the dry mass of m ycelia could reach（19.85±0.52）g/L.The dry mass of mycelia in 20 L fermenter was（16.78±0.06）g/L，which could reach 85%of that in 5 L fermenter.Through the com parison grow th curve of shaker and 5 L fermenter，it was found that pH value could reflect the change trend of mycelia dry mass，so the change rule of pH value could be used as a judgment data for end of the fermentation.

Cordyceps sinensis；submerged fermentation；mycelia；fermentation conditions；optim ization

Q815

0254-5071（2016）05-0070-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．015

2016-02-25

中山大學產學研項目（33000-7101338）

盛嘉?。?990-），男，碩士研究生，研究方向為應用生物技術。

葉克難（1964-），男，副教授，博士，研究方向為應用生物技術。