綠色熒光蛋白的原核表達純化用于基因工程大實驗的設計

張會勇 蔡亞麗 張青苗 張孟丹 胡嘯 井長勤

（新鄉醫學院生命科學技術學院 河南新鄉 453003）

綠色熒光蛋白的原核表達純化用于基因工程大實驗的設計

張會勇 蔡亞麗 張青苗 張孟丹 胡嘯 井長勤

（新鄉醫學院生命科學技術學院 河南新鄉 453003）

目的 通過設計基因工程實驗為一綜合性探究實驗，使學生全面掌握并提升基因工程相關實驗技能。方法 借助于綠色熒光蛋白的原核表達及純化實驗，使學生掌握了基因的克隆與表達、以及蛋白純化等綜合實驗性技術方法。結果 將以前支離破碎的一個個單個實驗環環相扣成為一個整體，最終學生可獲得一個肉眼可見的基因工程產物即綠色熒光蛋白。結論 通過基因工程實驗的改革提高了學生的學習興趣，得到了良好的學習效果。

基因工程實驗 綠色熒光蛋白 原核表達

如今分子生物學已成為生命科學的通用語言,因此誕生于分子生物學的基因工程實驗技術也被列為生命科學相關專業的主干課程［1-2］,所以掌握基因工程相關技術已成為生命科學相關專業人才的必備技能［3］。新鄉醫學院生命科學技術學院為生物技術及生物工程專業已開設基因工程實驗10年左右,基本內容包括電泳技術［瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）］,聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）技術、質粒提取、感受態制備、質粒轉化及蛋白印跡（western blotting）等技術。雖然開設內容也達到了培養生物技術及工程相關人才的基本要求,但相關實驗內容連貫不強,加上分子水平操作的枯燥及目標產物不可見性,導致學生雖然實驗之初興趣頗高,實驗最后卻不能有效將相關實驗銜接,最終導致最終興趣缺乏,達不到設想的教學效果。所以有必要對相關課程實驗進行改革、重置為綜合性實驗,用一個實驗內容將上述技術串聯起來。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein,GFP）首先在1962年由Shimomura等首先從多管水母中分離［4］,已證實可在大腸桿菌中表達出活性的GFP［5-6］,日光下菌體呈綠色［5］,且其表達純化步驟較為簡單［6］。所以作者設計GFP的原核表達及純化為一個綜合性實驗,通過將GFP基因克隆、酶切、連接、轉化以及篩選、表達及純化等,使學生通過綜合性實驗獲得了一個基因工程的可見產物,極大提高了學生的實驗興趣及成就感?，F將實驗的詳細方案報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

Pfu酶、PCR產物液體回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性內切酶Nco I、BamH I與DNA連接酶購自寶生物工程（大連）有限公司；BspH I酶購自美國NEB公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；BL-21,pcDNA3.1-GFP由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 GFP原核表達重組子的構建 引物設計：因為GFP序列（GenBank： AB594822.1）中含有Nco I序列,在設計上游引物時用了Nco I的同尾酶BspH I,然后用Oligo6軟件設計了它的表達引物并預測了其退火溫度。引物序列如下：GFP上游引物：5-GCGTCATGA（BspHI）CTAGCAAAGGAGAAGA-3；GFP 下游引物：5-GCGCGGATCC（BamHI）TCAGTTGTACAGTTCATCCATGCCA-3。首先以引物GFP 上游引物與GFP 下游引物組合,以真核生物表達載體pcDNA3.1-GFP為模板, PCR擴增GFP的開放閱讀框即 （open reading frame,ORF）,擴增條件如下：94℃預變性5 min后,94℃1 min,51℃1 min,72℃1 min, 30個循環,72℃終延伸10 min,反應體系為100 μL,液體回收純化PCR產物洗脫至50μL,并進行定量,濃度約0.15 g·L-1。然后分別用20U的BamHI和BspHI限制性內切酶對2μg回收PCR產物進行酶切、純化,對PET28a（1.5mL菌液經質粒提取試劑盒（小量）進行提取,最后用50μL洗脫液洗脫可獲得約1μg質粒）用BamH I與Nco I進行雙酶切、然后液體回收酶切產物；計算酶切載體與回收片段的摩爾比。按照載體片段1：10（0.3：0.03pmol）的比例進行T4 DNA連接酶16℃連接1 h,連接產物轉化BL21感受態細菌,涂布于表面涂有為20%（W/V）的乳糖（Luria-Bertani,LB）固體培養基（50 mg·L-1卡那霉素）37℃培養過夜；挑取變綠的陽性克隆, 擴大培養。

圖1 GFP PCR產物的擴增

圖2 陽性克隆的篩選

1.2.2 GFP蛋白的表達與純化 將篩選平板上變綠的陽性克隆接種于5mL試管中（含50 mg·L-1卡那霉素）,培養過夜,然后轉接于250mL LB培養基1L搖瓶中,200 r·min-1培養5 h后,加入濃度為20%的乳糖至終濃度為2%,繼續培養6～8 h,至肉眼可見菌體變綠,6 000r·min-1×5 min收集菌體。GFP的純化參閱文獻［6］；提純GFP蛋白用SDS-PAGE鑒定蛋白純度。

圖3 GFP蛋白SDS-PAGE電泳圖

2 結果

2.1 PCR結果結果見圖1。由圖1可以看出,PCR擴增產物分子量為750 bp附近,與預期相符,條帶單一可以進行下一步酶切實驗。

1：marker；2：GFPPCR擴增產物。

2.2 陽性克隆的篩選 結果見圖2。由圖2可見,LB平板上綠色克隆均為陽性克隆,因乳糖誘導GFP表達而使陽性克隆在平板上變為綠色。

2.3 GFP蛋白的純化結果 結果見圖3。由圖3可以看出,誘導菌體蛋白（泳道2）相對于未誘導對照菌體蛋白（泳道1）,已成功誘導出目的蛋白,且誘導菌體蛋白經硫酸銨沉淀及萃取等步驟后,可獲得電泳級的純化GFP（泳道4）。

1：蛋白分子量標準；；2：BL21-pET28a菌株表達的蛋白； 3：BL21-pET28a-GFP 菌株誘導表達蛋白； 4：GFP純化蛋白。

3 討論

本文首先規范化了GFP的原核表達實驗及純化步驟,使之成為一個學生可操作的實驗。

由GFP原核表達的綜合性實驗步驟我們可以看出,通過實驗操作使學生掌握了載體的構建、轉化、篩選、表達與蛋白純化等技術,不但使學生掌握了基因工程核心要素“目的基因克隆、酶切、連接、轉化及篩選”等上游過程,同時也使學生熟悉了蛋白純化部分基因工程下游技術。在此過程中同學們也學會了質粒提取、DNA瓊脂糖凝膠電泳與SDS-PAGE蛋白電泳技術以及蛋白表達和純化等實驗技術。將以前支離破碎的一個個單個實驗環環相扣成為一個整體。

另外,GFP是從水母中首先克隆出來的基因,能夠通過原核表達獲得其活性產物,使學生更直觀的認識到了基因工程可以跨越物種障礙,感受到基因工程的魅力。

GFP表達產物在日光下為肉眼可見的綠色,我們在篩選的卡那霉素抗性LB平板上涂了20%的半乳糖溶液,可直接通過綠色熒光蛋白的表達使陽性克隆變成綠色（圖2）,陽性與非陽性克隆一眼就能識別,并且肉眼可見的陽性克隆不存在假陽性問題,無需再用PCR及測序進行再次驗證。

第三,GFP蛋白的純化步驟相對簡單,僅需用硫酸銨及乙醇沉淀與萃取步驟即可得到電泳級的蛋白（圖3）,可使學生了解蛋白的純化一些基本技術。

本文通過設計GFP蛋白的原核表達及純化實驗為基因工程綜合實驗,改革了以前通過一個個單一實驗使學生逐項掌握單個技術為目的,變為使學生通過一個綜合大實驗,將逐個單一技術通過一個綜合實驗串聯起來,成為一個有機整體。通過此次實驗,學生可獲得一個肉眼可見的基因工程產物即綠色熒光蛋白,所以此次基因工程實驗的改革提高了學生的學習興趣,得到了良好的學習效果。

［1］邢萬金，扈延茂.本科基因工程大實驗教學改革的實踐和體會［J］.生物學通報，2007，42（2）：48-50.

［2］陳魯勇，孟和，許文平，等.分子生物學實驗教學改革與實踐［J］. 實驗室研究與探索，2008，27（12）：121-122.

［3］王文鋒，范雪暉，穆靈敏，等.生物技術專業基因工程實驗教學的改進與實踐［J］.新鄉醫學院學報，2009，01：99-100.

［4］Shimomura，O.，F.H.Johnson，and Y.Saiga.Extraction， purification and properties of aequorin，a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan，Aequorea［J］.J Cell Comp Physiol，1962，59：223～239.

［5］張會勇，魯勇，孟雨菡，等.VEGF183（132-158）肽段作為蛋白緩釋藥物載體的細胞外基質結合研究［J］.藥物生物技術，2010，03：198-202.

［6］Yakh nin AV，Vin ok urov LM， Su rin AK，et al . Green fluorescent protein purification by organic extraction ［J］.Protein Expr Purif，1998，14：382-386.

Q-4

A

1674-2060（2016）03-0001-02

2014年度河南省高等教育教學改革省級重點研究項目（編號：2014SJGLX050）

張會勇（1976—），男，漢族，博士，副教授，主要從事肽類藥物及腫瘤疫苗研究。