7F型肺炎鏈球菌多糖競爭ELISA檢測方法的建立

曾華英張偉林宏輝

（1.四川大學生命科學院 四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責任公司 四川成都 610023）

7F型肺炎鏈球菌多糖競爭ELISA檢測方法的建立

曾華英1，2張偉2林宏輝1

（1.四川大學生命科學院 四川成都 610064；2.成都生物制品研究所有限責任公司 四川成都 610023）

目的：建立檢測7F型肺炎鏈球菌莢膜多糖的方法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），檢測發酵過程中多糖的濃度。方法：包被物為7F型肺炎鏈球菌多糖，競爭物為待測多糖，建立間接競爭ELISA方法，并驗證其準確性和精密度。結果：最佳多糖包被質量濃度為2.5ug/ml，多糖抗體血清稀釋度為1：8×104。在檢測范圍為2.5～30μg/mL時呈線性相關，7F的最低檢測限為1.5μg/mL?；貧w方程為B/B0=-0.4075 Pn7F+0.7632，R2=0.9952.樣品加標回收率為95.13%-105%。結論：本研究新建的ELISA方法準確性和精密度較好，能特異性地檢測7F型肺炎球菌多糖。

肺炎鏈球菌 多糖 競爭ELISA 硫酸蒽酮法

肺炎鏈球菌是革蘭氏陽性菌,是社區獲得性肺炎最常見的病因,并引起腦膜炎、敗血癥、中耳炎等疾病。目前抗生素耐藥性日益加劇,研發相關疫苗顯得尤為重要。肺炎鏈球菌的主要致病因子為莢膜多糖,其具有良好的免疫原性和安全性。在已分離得到的90個血清型肺炎鏈球菌中,約有20多個血清型涵蓋了大約90%的致病原。已上市的23價肺炎莢膜多糖疫苗對小于2 周歲及大于60 周歲的高危人群的保護性較差,而7價肺炎結合疫苗具有很好的免疫效果,但由于血清型覆蓋范圍有限而影響其在更廣的范圍應用。13價結合疫苗血清型覆蓋更廣,為國內的肺炎球菌性疾病的預防帶來很大的幫助。7F血清型在13價肺炎結合疫苗內,根據相關資料,制備出7F型莢膜多糖。

硫酸蒽酮法是檢測肺炎莢膜多糖的常規方法。糖在濃硫酸作用下生成糠醛或羥甲基糠醛,與蒽酮反應生成藍綠色糠醛衍生物。在一定波長范圍內,顏色的深淺與糖的含量成正比。硫酸蒽酮方法只能測定總碳水化合物,不適合于細菌發酵過程的培養。因為細菌培養中含有大量的葡萄糖等雜質會干擾多糖測定結果,而且其靈敏性欠佳,部分血清型多糖在較高濃度才能被檢出。應用速率比濁法和火箭免疫電泳法也可以檢測培養中的多糖含量,但是這些方法需要特殊的設備和大量的血清,不利于生產成本的控制。

表1 方陣法確定肺炎鏈球菌7F型多糖最適包被濃度

表2 方正法確定肺炎鏈球菌7F型多糖最適血清工作濃度

表3 不同多糖濃度Pn7F抑制率

本研究通過建立競爭ELISA法對培養過程中的7F多糖濃度檢測,監控多糖發酵和純化,提高多糖收率有著重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料和設備

7F肺炎鏈球菌莢膜多糖及標準品（ATCC）,低溫保存；7F血清購自丹麥血清研究所；酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗兔血清、四甲基聯苯胺顯色液（TMB）購自美國KPL公司。酶標儀購自美國Molecular Devices公司,型號為Versamax。96孔酶標板購自丹麥Nunc公司。

1.2建立檢測方法

表4 7F血清型肺炎鏈球菌多糖競爭ELlSA的準確性和批內精密度

圖1 肺炎鏈球菌7F型多糖包被濃度確定

圖2 肺炎球菌7F多糖血清工作濃度確定

圖3 肺炎球菌7F多糖競爭ELISA標準曲線

1.2.1 確定最適包被抗原濃度和多糖抗血清工作濃度

系列稀釋7F肺炎球菌多糖標準品和多糖抗體血清,采用方陣滴定法確定最適抗原包被濃度和血清濃度。在96孔酶標板中用PBS（PH7.4）溶液橫向倍比稀釋包被抗原,100ul/孔,2-8°過夜。次日取出洗板,用3%BSA的PBS封閉液300ul/孔室溫封閉1小時。洗板加入待測多糖樣品和多糖抗體血清,分別為50ul/孔,室溫1小時；洗板后加入二抗,100ul/孔,室溫45分鐘；洗板,加入TMB顯色,室溫15min后加入0.5mol/LH2S04終止反應。在酶標儀讀取450nm波長的吸光度,確定最適包被濃度和多糖抗體血清工作濃度。

1.2.2 建立標準曲線

最適包被濃度包被酶標板,利用建立的競爭ELISA法對7F多糖標準品不同濃度進行檢測。以多糖濃度的對數值為橫坐標,以各標準品濃度吸光度值為縱坐標繪制曲線,該曲線在一定自變量范圍內呈線性相關,計算出回歸方程和相關系數（R2）。

1.3 驗證方法

圖4肺炎球菌7F多糖競爭ELISA特異性驗證

1.3.1 特異性驗證

將7F型肺炎球菌標準多糖高濃度（200ug/ml）與其他型肺炎多糖（1,6B,9V型20ug/ml

）等體積混合.用建立的競爭ELISA法檢測7F型肺炎球菌多糖的質量濃度,對照加入同體積的PBS（7.4）和7F型標準多糖,比較兩者的結果。

1.3.2 準確度驗證

用建立的競爭ELISA法檢測已知樣品及在該樣品中添加高中低三個濃度的7F型多糖標準品的加標樣品。每個樣品測定3次,計算相對標準差和加標回收率。

2 實驗結果

2.1 最適抗原包被濃度和多糖抗體血清工作濃度

根據每個血清稀釋度最大反應對應的包被濃度,確定最適抗原包被濃度為2.5ug/ml,見表1和圖1。

綜合考慮靈敏度與反應值,當抗多糖血清稀釋度為1：8×104時,靈敏度較高,見表2與圖2。

2.2 檢測范圍及標準曲線的確定

包被濃度2.5ug/ml,血清稀釋度為1：8×104進行競爭ELISA法測定,制備標準曲線。將不同濃度Pn7F對應的A450轉換為B/B0,無多糖抑制時的A450為B0,各質量濃度的肺炎球菌多糖抑制時的A450為B。由表3可知,當多糖質量濃度大于1.25ug/ml 時,有明顯抑制作用。最低檢測限為1.25 ug/ml 。B/B0與lg［Pn7F］ 在一定自變量范圍內呈線性相關。圖3可知Pn7F在2.5-30ug/ml的質量濃度范圍內,具有良好的線性,回歸方程y = -0.4075x + 0.7632和相關系數R2=0.9952。

2.2 特異性驗證

將肺炎球菌7F型標準多糖高濃度（200ug/ml）與若干其他型肺炎多糖（1,6B,9V,14,19F型40ug/ml）等體積混合.用建立的競爭ELISA法檢測Pn7F的多糖質量濃度,對照加入同體積的Pn7F型標準多糖與PBS（PH7.4）混合,比較兩者的結果,P＞0.05二者無明顯差異,見圖4。

2.3 準確性和批內精密度

用建立的競爭ELISA方法做加樣回收,在已知多糖濃度A中分別加入高中低三個濃度B（5ug/ml）,C（15ug/ml）,D（20ug/ml）的7F多糖標準品的樣品,在A450nm測得吸光度,A值為11.48ug/ml,回收率在95.13%-105%,批內RSD在0.98%-1.28%,結果見表4。

3 討論

肺炎球菌多糖培養過程中產生多樣雜質,如果要采用硫酸咔唑、硫酸蒽酮等化學方法是檢測培養過程中的莢膜多糖含量,就需要對樣品進行超濾離心等多步預處理來除去雜質。步驟不僅繁瑣,而且會損失多糖,無法真實反映發酵過程的多糖表達量。速率比濁法和火箭免疫電泳法需要大量的血清和特殊設備,生產成本增加。競爭酶聯免疫吸附法有直接法和間接法兩種,前者需要預先制備酶標抗原或抗體,步驟繁瑣且重復性不佳。本方法研究間接競爭ELISA法檢測多糖,利用多糖抗體（一抗）與多糖結合后,加入廣譜抗兔抗體酶標二抗,與第一抗體反應有信號放大作用,其靈敏度明顯高于化學法。本研究通過優化多糖包被濃度及多糖抗血清稀釋度,在保證較大檢測范圍且良好線性的情況下,有效減少了多糖抗血清的用量（稀釋度為1∶8×104）,降低了檢測成本。同時驗證了該法的特異性和準確度、精密度,結果表明該法穩定,適用于監控多糖培養過程中的濃度變化。

［1］李雪蓮，汪麗.七價肺炎球菌結合疫苗預防嬰幼兒肺炎的臨床分析［J］.重慶醫學，2011，40（5）：1523.

［2］李巖松，柳增善，周玉等.伏馬菌素FB2間接競爭ELISA檢測方法的建立［J］.中國獸醫學報，2009，29（9）：1204-1207.

Q3-3

A

1674-2060（2016）03-0019-03

曾華英（1981—），四川大學生命科學院2012級碩士研究生，研究方向：生物工程。林宏輝，四川大學生命科學院教授，研究方向：植物逆境分子生物學及植物代謝工程。