血管緊張素轉化酶抑制肽LAP改善血壓及心室重構的研究

黃俊玲 羅 明 謝南姿 沈 藝 羅幫鎮 王海峰 劉 陽

?

血管緊張素轉化酶抑制肽LAP改善血壓及心室重構的研究

黃俊玲 羅 明 謝南姿 沈 藝 羅幫鎮 王海峰 劉 陽

目的：探討血管緊張素轉化酶抑制肽LAP的長期降壓效果及對心室重構的干預作用。 方法：選取10周齡雄性自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為動物模型，隨機分為空白對照組、依那普利組(Ena組)和LAP組。干預時間為8周，干預期間監測SHR的血壓變化，干預結束后對SHR的心臟形態、心臟功能、心肌肥厚程度及心肌纖維化指標進行檢測。 結果：(1)干預2周后LAP組血壓明顯低于空白對照組(P<0.05)，降壓效果持續至干預結束；LAP組與Ena組比較血壓無顯著性差異。(2)干預8周后，與空白對照組相比，LAP組及Ena組室間隔厚度(IVST)、 左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVSd)、左室后壁收縮末期厚度(LVPWTs)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWTd)明顯下降(P<0.05)，左室短軸縮短率(FS)、射血分數(EF)、心輸出量(CO)明顯升高(P<0.05)；心室肌肥厚指數(VMI)明顯下降(P<0.05)；而LAP組與Ena組比較，上述各指標無顯著性差異。(3)干預8周后，HE染色下，空白對照組心肌纖維結構明顯紊亂，LAP組及Ena組較空白對照組心肌纖維明顯纖細，纖維結構略有紊亂；Masson染色下，與空白對照組相比，LAP組及Ena組心肌膠原容積分數(CVF)和血管周圍膠原面積(PVCA)明顯下降(P<0.05)，LAP組及Ena組間比較無顯著性差異。 結論：LAP對SHR可長期有效降壓，能改善SHR的心臟功能，逆轉左心室重構。

血管緊張素轉化酶抑制肽；高血壓；心室重構

左心室肥厚是高血壓的重要病理變化，其進程中伴隨著心室重構[1]。心肌纖維化以心肌膠原濃度增加或心肌膠原容積分數(CVF)增高為特征，是心力衰竭的重要機制之一，使高血壓患者發生心血管事件的危險性明顯增加[2-3]。對心肌纖維化進行干預，能有效抑制心室重構，延緩心力衰竭的發生和發展。腎素-血管緊張素系統(RAS)是引起心室重構的重要因素[4]，血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)可有效降壓，并可抑制和逆轉心室重構[5]，但同時具有較多不良反應。天然來源的血管緊張素轉化酶(ACE)抑制肽能有效抑制ACE的作用，達到降壓目的，且具有安全性高、不良反應小等特點。本研究以自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat，SHR)為動物模型，通過腹腔注射合成的ACE抑制肽LAP，觀察其長期降壓效果，并探討其對心室重構的干預作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

10周齡SHR 30只，清潔級，雄性，體重250～300 g，合格證號：SCXK(滬2007-0005)，購自上海斯萊克試驗動物有限責任公司。

1.2 實驗分組及干預方法

SHR隨機分為3組，每組10只，每天同一時間腹腔注射藥物?？瞻讓φ战M：不給藥；依那普利組(Ena組)：注射依那普利1 mg/kg·d-1(依那普利溶于0.5 mL生理鹽水中)；LAP組：注射LAP 50 μg/d(LAP由上海強耀生物科技有限公司合成，取LAP 500 μg，溶于2.5 mL生理鹽水，加2.5 mL弗氏不完全佐劑，充分乳化，每只注射0.5 mL)。干預時間共8周。

1.3 血壓檢測

用大鼠血壓測定儀測量實驗前及實驗期間的大鼠血壓，實驗期間每周測量1次，每次每只測量3次，收縮壓及舒張壓各取3次的平均值。

1.4 超聲心動圖檢測

干預結束后，動物超聲心動圖檢測大鼠的心臟形態和功能。用氯胺酮1 mL/kg腹腔注射麻醉，大鼠左胸前剃毛，用頻率17.5 Hz探頭置于大鼠胸骨左側，與胸骨中線成角10°～30°，顯示胸骨旁左側短軸左室乳頭肌水平切面，由二維圖像引導取M型曲線進行測量。測量指標包括室間隔厚度(IVST)、左室舒張末期內徑(LVDd)、左室收縮末期內徑(LVSd)、左室后壁收縮末期厚度(LVPWTs)、左室后壁舒張末期厚度(LVPWTd)。超聲儀自動計算出左室短軸縮短率(FS)、射血分數(EF)、心輸出量(CO)。各指標均測量連續3個心動周期，取平均值。

1.5 心室肥厚程度檢測

心室肌肥厚指數(VMI)是反映心室肥厚程度的指標，為心室質量(VW)與體質量(BW)的比值。用電子天平稱取大鼠BW，3%戊巴比妥鈉1 mL/kg腹腔注射麻醉，迅速解剖取心臟，去除心房、大血管和心包組織，生理鹽水沖洗，清潔濾紙吸干水分，用電子天平稱取VW，計算VW與BW的比值。

1.6 心肌纖維化指標定性和定量分析

心室組織于4%多聚甲醛固定2 d，經包埋、脫水、切片，制成3 μm厚標本。用計算機輔助圖像分析系統，HE染色后觀察心室肌的基本病理變化。Masson染色后，測定CVF和血管周圍膠原面積(PVCA)。切片上隨機取8個視野，通過灰度調節區別膠原和非膠原成分，CVF為膠原面積與心肌面積的比值，取平均值，其中膠原面積不包括血管周圍膠原面積。切片上隨機取4支呈橫切面的小動脈，測量動脈周圍膠原面積與血管腔面積，計算比值，取其平均值作為PVCA。

1.7 統計學分析

實驗數據以均數±標準差表示，采用SPSS11.5軟件進行統計學分析，進行正態性檢驗后，組間計量資料比較采用方差分析，率的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為有顯著性差異。

2 結果

2.1 血壓變化情況

3組SHR 10周齡時收縮壓及舒張壓無顯著性差異；用藥2周后，LAP組及Ena組收縮壓及舒張壓均明顯低于空白對照組(P<0.05)，Ena組降壓作用略強于LAP組，但兩組間比較無顯著性差異。與空白對照組相比，LAP組及Ena組降壓作用持續至實驗結束(P<0.05)。SHR 18周齡時，Ena組降壓作用仍略強于LAP組，但兩組間收縮壓及舒張壓比較仍無顯著性差異。見表1。

2.2 超聲心動圖指標

經過8周的干預，超聲心動圖檢查結果顯示，與空白對照組相比，LAP組及Ena組IVST、LVDd、LVSd、LVPWTs、LVPWTd均明顯下降(P<0.05)，FS、EF、CO明顯升高(P<0.05)；而LAP組與Ena組比較，上述指標無顯著性差異，見表2。

表1 各組大鼠尾動脈收縮壓及舒張壓/mmHg

注：與空白對照組相比，(1)P<0.05

表2 各組超聲心動圖指標比較

注：與空白對照組相比，(1)P<0.05

2.3 心室肥厚程度指標

經過8周的干預，LAP組及Ena組VMI與空白對照組相比均明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)；LAP組與Ena組比較VMI無顯著性差異，見表3。

2.4 心肌纖維化指標

經過8周的干預，心肌組織的HE染色顯示，空白對照組心肌纖維結構明顯紊亂，LAP組及Ena組較空白對照組心肌纖維明顯纖細，結構略有紊亂，見圖1。

Masson染色下，心肌細胞核呈藍黑色，胞漿呈紅色，膠原纖維呈藍色?？瞻讓φ战MSHR心肌纖維變粗，部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，細胞間隙及血管壁周圍可見大量膠原纖維增生，而LAP組和Ena組心肌纖維略變粗，排列較整齊，細胞間隙及血管壁周圍膠原纖維增生不明顯，見圖2。LAP組及Ena組與空白對照組相比，CVF和PVCA均有明顯下降(P<0.05)，但LAP組與Ena組比較CVF和PVCA無顯著性差異，見表4。

表3 各組心室肌肥厚指數比較

注：與空白對照組相比，(1)P<0.05

注：A為空白對照組；B為Ena組；C為LAP組圖1 各組SHR心肌組織HE染色

注：A為空白對照組；B為Ena組；C為LAP組圖2 各組SHR心肌組織Masson染色

表4 各組心肌組織CVF、PVCA比較

注：與空白對照組相比，(1)P<0.01，(2)P<0.05

3 討論

國內外已有多項研究證實，ACEI能有效降壓，改善高血壓心室重構，且ACEI治療高血壓具有類效應[6]。 張靜等[7]研究證實，依那普利可降低老年SHR過高的左心室負荷，改善心功能減退癥狀，逆轉SHR的左心室質量指數升高及心肌細胞肥大。研究證實海產品來源的ACE抑制肽對高血壓大鼠有顯著的降壓作用，每天給予ACE抑制肽，可使SHR血壓明顯下降，降壓效果與卡托普利相似，而未發現明顯的不良反應[8]。但是ACE抑制肽對大鼠心室重構的作用是否與ACEI類藥物相似，尚無相關研究。

本研究中使用的ACE抑制肽LAP由6個氨基酸殘基(亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-纈氨酸-丙氨酸-丙氨酸)組成，其結構與食物源性自然肽相似，故安全性較高。體外實驗證實LAP有抑制ACE的作用，呈濃度依賴性，半抑制濃度IC50為4.14 μmol/L，與食物源性自然肽對ACE的抑制作用相似，且可以用化學合成的方法大量生產[9]。我們前期研究已證實，LAP對SHR有顯著的降壓效果，可改善SHR的血管重構，效果與依那普利相似[10]。本實驗對SHR腹腔注射LAP，2周后血壓下降，降壓作用持續至實驗結束，證明LAP對SHR可長期有效降壓。

本研究還證實了LAP能明顯改善SHR的心臟功能、心室肥厚和心肌間質纖維化。經過8周的干預，與空白對照組相比，LAP組和Ena組的FS、EF、CO、LVDd、LVSd等反映心臟功能的指標改善；VMI、IVST、LVPWTs、LVPWTd 等反映心肌肥厚的指標降低，心肌纖維明顯纖細且排列整齊；反映心肌纖維化的指標CVF和PVCA明顯降低；而上述指標在LAP組與Ena組之間無明顯統計學差異。提示LAP能有效改善SHR的左心室重構，改善心功能，效果與ACEI類藥物依那普利相似。

綜上所述，LAP對SHR可長期有效降壓，能抑制心室肥厚，減少心肌纖維化，改善心室重構，有望成為高血壓治療及靶器官保護的新型藥物。

[1] Katragadda S, Arora RR. Role of angiotensin-converting enzyme inhibitors in vascular modulation: beyond the hypertensive effects[J]. Am J Ther, 2010,17(1):e11-23.

[2] 沈芳芳,邵 湍,申進閣，等.通心絡膠囊對擴張型心肌病大鼠心功能和心室重構的影響[J].國際心血管病雜志,2013,40(6):372-375.

[3] Kumarswamy R，Thum T. Non-coding RNAs in cardiac remodeling and heart failure[J].Circ Res，2013，113(6):676-689.

[4] 楊 君，楊 龍，唐 倩，等．替米沙坦在牽張刺激導致的心室肌細胞延遲整流鉀通道改變中的作用[J].國際心血管病雜志,2015,42(1):51-57.

[5] Hughes AD, Stanton AV, Jabbar AS, et al. Effect of antihypertensive treatment on retinal microvascular changes in hypertension[J].J Hypertens, 2008,26(8):1703-1707.

[6] Labat C, Lacolley P,Lajemi M,et al.Effects of valsartan on mechanical properties of the carotid artery in spontaneously hypertensive rats under high-salt diet[J].Hypertension，2001，38(3):439-443.

[7] 張 靜，高 歡.依那普利對老年自發性高血壓大鼠心功能和心室重構的改善作用[J].中國老年學雜志，2014，34(16):4616-4617.

[8] Zhao YH, Li BF, Dong SY, et al. A novel ACE inhibitory peptide isolated from Acaudina molpadioides hydrolysate[J].Peptides，2009，30(6):1028-1033.

[9] Hong F, Ming L, Yi S, et al. The antihypertensive effect of peptides: a novel alternative to drugs[J]．Peptides,2008,29(6):1062-1071.

[10] Junling H, Ming L, Hong F, et al. Effects of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide LAP on vascular remodeling[J].Clin Exp Hypertens，2013，35(6):437-443.

(收稿：2016-02-01 修回：2016-06-11)

(本文編輯：胡曉靜)

The effects of angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide LAP to blood pressure and ventricular remodeling

HUANGJunling,LUOMing,XIENanzi,SHENYi,LUOBangzhen,WANGHaifeng,LIUYang.

DepartmentofGeriatrics，TongjiHospitalaffiliatedtoTongjiUniversity，Shanghai200065,China

Objective:To study the protective effects of angiotensin-converting enzyme (ACE)-inhibitory peptide LAP on blood pressure and ventricular remodeling. Methods:Ten-week-old male spontaneously hypertensive rats (SHR) were divided into three groups: blank control group, enalapril (Ena) group and ACE-inhibitory peptide LAP-treated (LAP) group. Each group was treated for 8 weeks. The alterations of blood pressure (BP), cardiac morphology, cardiac function, cardiac hypertrophy and morphological changes of myocardial fibers were investigated. Results:(1) After 2 weeks intervention，the BP of LAP group was significantly lower than blank control group (P<0.05)，the effect lasted till the end of the study，the difference between LAP group and Ena group was not significant. (2) After 8 weeks intervention，as compared with blank control group，the IVST, LVDd, LVSd, LVPWTs, LVPWTd and VMI of LAP group and Ena group were significantly lower (P<0.05)，while FS, EF and CO were significantly higher (P<0.05). But there was no significant differences between LAP group and Ena group. (3) After 8 weeks intervention，by HE staining，the structures of myocardial fibers in blank control group were obviously disordered. In LAP group and Ena group, myocardial fibers were significantly thinner than those in blank control group and their structures were slightly disordered. By Masson staining，the CVF and PVCA in LAP group and Ena group were significantly lower than those in blank control group (P<0.05)，but there was no significant difference between two groups. Conclusion: LAP has a long-term beneficial effect on BP of SHR. It can improve the SHR′s heart function and reverse left ventricular remodeling.

Angiotensin-converting enzyme inhibitory peptide； Hypertension； Ventricular remodeling

上海市自然科學基金(10ZR1433200)；同濟大學附屬同濟醫院院級課題(TJ1505)

200065 上海，同濟大學附屬同濟醫院老年科

羅 明，Email：Lmfc84@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2016.05.011