響應面法優化蛇床子中蛇床子素的酶法提取工藝

寧娜??+韓建軍??+胡宇莉++鄒宗堯??+郁建生

摘要：采用蛇床子素作為原料，通過酶法從蛇床子中提取蛇床子素，并以蛇床子素提取率為指標，研究料液比、酶種類、酶用量等因素的影響。在單因素試驗基礎上，選取酶用量、酶解溫度、酶解時間以及酶解pH值進行了4因素3水平的Box-Behnken試驗設計。結果表明，最優提取條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時間125 min、酶解pH值4.6，在此條件下蛇床子素的提取率可達95.13 %。

關鍵詞：蛇床子；蛇床子素；復合酶；提??；響應曲面法

中圖分類號： R284.2文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0169-05

床子為傘形科植物蛇床[Cnidium monnieri （L.） Cuss.]的干燥成熟果實，具有燥濕祛風、殺蟲止癢、溫腎壯陽之功效，臨床上用于陰癢帶下、宮冷不孕等癥[1]。蛇床子中含有香豆素類[2]、酚苷類[3]、揮發油[4]等多種化學成分，其中蛇床子素是蛇床子藥材的質控成分[1]。體內藥理研究表明蛇床子素具有抗炎[5]、神經保護[6]、降血糖[7]等活性。

目前已報道的從蛇床子中提取蛇床子素的方法主要有乙醇回流法[8-9]、超聲法[10]、微波法[11]等。生物酶解技術是通過生物酶破壞植物細胞壁從而促進有效成分提取，該方法具有提取效率高、反應條件溫和、專一性強且易于控制等優點[12-14]?，F在越來越多的研究將生物酶解技術應用于中藥有效成分的提取中，以達到提高有效成分的提取率、縮短提取時間、減少提取溶劑用量等目的[15-17]。采用生物酶解技術提取蛇床子中蛇床子素的研究尚未見報道。本研究采用生物酶提取蛇床子中蛇床子素成分，并通過響應面法優化該提取工藝，為蛇床子中蛇床子素的工業化生產提供參考。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

蛇床子藥材購于河北安國中藥材市場，經鑒定為傘形科植物蛇床子[Cnidium monnieri （L.） Cuss.]的干燥成熟果實；蛇床子素標準品購自中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶（酶活性為22 000 U/g）購自寧夏和氏璧生物技術有限公司；水為重蒸水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀（手動進樣器、在線脫氣機、四元泵、DAD檢測器和Agilent ChemStation 色譜工作站），美國Agilent公司生產；SK8200H 超聲清洗器，上?？茖С晝x器有限公司生產；pHS-3C精密pH計，上海光學儀器廠生產；METTLER AE240型十萬分之一電子天平，德國梅特勒公司生產；RE-2000A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠生產；DK-S26電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司生產；FZ102微型植物粉碎機，天津泰斯特儀器有限公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1HPLC法測定蛇床子素的含量

1.2.1.1色譜條件Agiletn Zorbax SB-C18柱（5 μm，4.6 ×250.0 mm2）；流動相：乙腈/水（65/35，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：322 nm；進樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數以蛇床子素峰計算不低于3 000。該色譜條件下測定蛇床子素標準品及蛇床子藥材得到的色譜圖見圖1。

1.2.1.2標準曲線的繪制精密稱定蛇床子素對照品 12.5 mg 置于25 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻，分別精確量取此溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL至10 mL容量瓶中，并用無水乙醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述所配制的對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照上述色譜條件測定。以測得的峰面積y為縱坐標，以標準品的進樣濃度x（μg/mL）為橫坐標繪制標準曲線。蛇床子素質量濃度在5～50 μg/mL 范圍時，線性方程為y=18 467.46x-3 362.07，相關系數r=0.999 7，線性良好。

1.2.1.3蛇床子藥材中蛇床子素的含量測定本研究所用的蛇床子藥材按照《中國藥典》2010版一部蛇床子項下方法進行含量測定，表明本試驗中所用蛇床子藥材中蛇床子素的含量為1. 65%。

1.2.2蛇床子素的提取及提取率的計算取干燥的蛇床子藥材用中藥材粉碎機粉碎，過40目篩，取10 g 蛇床子粉末加入一定量的生物酶后，再按照一定的料液比加入蒸餾水，在一定溫度、pH值條件下酶解一定時間后，過濾，收集提取液，并將所得提取液濃縮后，用無水乙醇定容至100 mL，備用。用移液管精密吸取上述定容后的蛇床子提取液0.7 mL轉移至50 mL容量瓶中，加無水乙醇定容至刻度，搖勻，所得溶液經0.45 μm 微孔濾膜過濾后，取續濾液10 μL按照上述色譜條件進行測定，并根據峰面積計算蛇床子素的提取率。蛇床子素提取率的計算公式：蛇床子素提取率=提取出的蛇床子素質量/蛇床子藥材中蛇床子素質量×100%。

2結果與分析

2.1單因素試驗

2.1.1酶種類對蛇床子素提取率的影響準確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，分別加入酶用量為10 mg/g的纖維素酶、果膠酶、復合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=2 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]1、1 ∶[KG-*3]2），在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時間120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結果見圖2。

由圖2可知，與單一酶相比，由不同比例的纖維素酶和果膠酶組合成的復合酶對蛇床子中蛇床子素均有較好的提取效果。當纖維素酶和果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合用于酶解提取時，蛇床子素的提取率最高，因此選用復合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）提取蛇床子素。

2.1.2料液比對蛇床子素提取率的影響準確稱取10 g蛇床子粉末，按照不同料液比（1 ∶[KG-*3]10、1 ∶[KG-*3]20、1 ∶[KG-*3]30、1 ∶[KG-*3]40、1 ∶[KG-*3]50，g ∶[KG-*3]mL）加入蒸餾水，在復合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時間120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結果見圖3。

由圖3可知，料液比小于1 g ∶[KG-*3]30 mL時，蛇床子素提取率隨著溶劑用量的增加而增大。當料液比為1 g ∶[KG-*3]30 mL時蛇床子素提取率達到最大，此后隨著溶劑用量的進一步增加，蛇床子素提取率呈下降趨勢。這是由于過多的溶劑會使提取溶液中生物酶的有效濃度降低，同時，提取溶劑用量過大也會增加后續濃縮過程的工作量。因此提取溶劑的料液比選定為1 g ∶[KG-*3]30 mL。

2.1.3酶用量對蛇床子素提取率的影響準確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，加入一定量的由纖維素與果膠酶按1 ∶[KG-*3]1組合成的復合酶（6、8、10、12、14 mg/g），在酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃的條件下酶解時間120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結果見圖4。

由圖4可知，酶用量在6～10 mg/g時，蛇床子素提取率隨酶用量的增加而明顯升高，當酶用量超過10 mg/g時，蛇床子素提取率增加的趨勢有所平緩。因此酶用量宜選擇在 10 mg/g 左右。

2.1.4酶解溫度對蛇床子素提取率的影響準確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，復合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0，在一定酶解溫度（30、40、50、60、70 ℃）下酶解120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結果見圖5。

由圖5可知，當酶解溫度低于50 ℃時，蛇床子素提取率隨著酶解溫度的升高而增加，當酶解溫度達到50 ℃時，蛇床子素提取率達到最大。隨著酶解溫度的進一步升高，蛇床子素提取率有所下降。這是因為低于生物酶的最適溫度時，溫度升高可促進生物酶活性的增強，而高于生物酶的最適溫度時可引起酶蛋白的變性，從而降低生物酶的催化活力。因此酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.1.5酶解時間對蛇床子素提取率的影響準確稱取10 g蛇床子粉末，加300 mL 蒸餾水，在復合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為 50 ℃ 的條件下酶解一定時間（60、120、180、240、300 min）后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結果見圖6。

由圖6可知，酶解時間在60～120 min時，蛇床子素提取率隨著酶解時間延長而明顯升高。當酶解時間超過120 min時，蛇床子素提取率增加的趨勢有所平緩。因此酶解時間宜選在120 min左右。

2.1.6酶解pH值對蛇床子素提取率的影響準確稱取 10 g 蛇床子粉末，加300 mL蒸餾水，復合酶（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）用量為10 mg/g、酶解pH值為5.0、酶解溫度為50 ℃，在一定pH值（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0）的條件下酶解120 min后，過濾，收集濾液，并計算蛇床子素提取率，結果見圖7。

2響應面分析響應曲面陡峭程度可反映各個因素及因素交互作用對蛇床子素提取率影響的強弱。由圖8可知，在各個因素中，酶用量對蛇床子素提取率的影響最大，酶解pH值的影響次之，酶解溫度和酶解時間的影響均較??；交互作用中，酶用量與酶解溫度、酶解溫度和酶解pH值的交互作用對蛇床子素提取率影響較強，而酶用量與酶解時間、酶用量與酶解pH值、酶解溫度與酶解時間、酶解時間與酶解pH值交互作用的影響較弱，與上述方差分析結果一致。

2.2.3最佳工藝條件及模型驗證經過Design-Expert 8.0.6 軟件分析，結合單因素試驗結果，得到酶法提取蛇床子中蛇床子素的最佳工藝條件為料液比 1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.44 mg/g、酶解溫度45.99 ℃、酶解時間124.64 min、酶解pH值4.58，蛇床子中蛇床子素的理論提取率為95.43%。為驗證方法的可行性，采用上述條件對蛇床子中蛇床子素進行提取，考慮到試驗操作的可控性，將得到的優化條件修正為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時間 125 min、酶解pH值4.6，進行3組平行試驗，測定蛇床子素的實際平均提取率為95.13 %，試驗結果與模型預測相對誤差僅為 0.3%，較為接近，驗證了響應曲面法回歸模型的合理性。通過本試驗結果與已經報道的文獻結果[8-11]對比，可知生物酶解技術可有效提高蛇床子中蛇床子素的提取率，不僅可減少有機溶劑的使用，同時極大地縮短了提取時間，可為工業生產提供參考。

3結論

通過單因素試驗、Box-Behnken試驗設計及響應面分析，得到優化的酶法提取蛇床子中蛇床子素的工藝提取條件為料液比1 g ∶[KG-*3]30 mL、酶用量（纖維素酶 ∶[KG-*3]果膠酶=1 ∶[KG-*3]1）10.4 mg/g、酶解溫度46 ℃、酶解時間125 min、酶解pH值 4.6，在此條件下蛇床子素的提取率可達95.13 %，

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中國藥典（一部）[M]. 北京：中國醫藥科技出版社，2010：295-296.

[2]Lee T H，Chen Y C，Hwang T L，et al. New coumarins and anti-inflammatory constituents from the fruits of Cnidium monnieri[J]. International Journal of Molecular Sciences，2014，15（6）：9566-9578.

[3]Kim S B，Chang B Y，Han S B，et al. A new phenolic glycoside from Cnidium monnieri fruits[J]. Natural Product Research，2013，27（21）：1945-1948.

[4]Chen Q H，Li P，Yuan F J，et al. Identification and quantification of the volatile constituents in Cnidium monnieri using supercritical fluid extraction followed by GC-MS[J]. Journal of Separation Science，2009，32（2）：252-257.

[5]Wang X L，Shang X，Cui Y，et al. Osthole inhibits inflammatory cytokine release through PPAR α/γ-mediated mechanisms in LPS-stimulated 3T3-L1 adipocytes[J]. Immunopharmacology and Immunotoxicology，2015，37（2）：185-192.

[6]Chen Z W，Mao X X，Liu A M，et al. Osthole，a natural coumarin improves cognitive impairments and BBB dysfunction after transient global brain ischemia in C57 BL/6J mice：involvement of Nrf2 pathway[J]. Neurochemical Research，2015，40（1）：186-194.

[7]Lee W H，Wu H H，Huang W J，et al. N-hydroxycinnamide derivatives of osthole ameliorate hyperglycemia through activation of AMPK and p38 MAPK[J]. Molecules，2015，20（3）：4516-4529.

[8]鄧洪，谷丹丹，陽勇，等. 蛇床子中蛇床子素提取工藝的優化[J]. 華西藥學雜志，2013，28（1）：106-107.

[9]張力力，黃靜，張琦. 響應曲面法優化蛇床子中蛇床子素的提取工藝[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2014（9）：45-49.[ZK）]

[10]王銳，楊婧，謝國梁，等. 超聲法聯合表面活性劑提取蛇床子中蛇床子素的研究[J]. 時珍國醫國藥，2013，24（3）：603-604.

[11]路強，王雅梅，王喜明. 蛇床子素提取方法的研究[J]. 內蒙古農業大學學報：自然科學版，2010，31（2）：298-300.

[12]高鐿萌，徐愿堅，杜洪飛，等. 中藥提取新技術的研究進展[J]. 世界科學技術：中醫藥現代化，2014（4）：890-894.

[13]蔡延渠，朱盛山，李潤萍，等. 新型提取聯用技術在中藥提取中的應用進展[J]. 中成藥，2011，33（5）：863-866.

[14]劉明言，王幫臣. 用于中藥提取的新技術進展[J]. 中草藥，2010，41（2）：169-175.

[15]程軒軒，郭楚楚，周鳳燕，等. 響應面法優化廣金錢草中總黃酮的酶法提取工藝[J]. 華西藥學雜志，2015，30（1）：70-73.

[16]何艾，李維國，竇志浩，等. 纖維素酶輔助提取沉香葉黃酮及其抗氧化活性測定[J]. 食品科技，2015，40（5）：233-237.

[17]王曉林，鐘方麗，薛健飛，等. 酶法提取刺玫果總黃酮工藝研究[J]. 北方園藝，2015，39（4）：136-139.