免標記法快速檢測啶蟲脒的研究

王承克+陳丹+張俊俊+陸峰

摘要：發展了一種利用納米金探針，免標記法檢測啶蟲脒的方法。本方法基于適配體能夠使納米金在NaCl溶液中保持一定的穩定性，當啶蟲脒存在時，由于啶蟲脒與適配體特異性的相互作用，使納米金穩定性降低，在NaCl存在時發生聚集的原理，根據溶液吸收光譜630 nm波長處吸光度值的改變，利用酶標儀實現了啶蟲脒的快速定量檢測。檢測線性范圍為2～20 nmol/L，檢測限為2 nmol/L，檢測過程在5 min內即可完成。本方法還成功用于實際水樣（校園湖水）中啶蟲脒的檢測。結果表明此方法具有較好的選擇性和較高的靈敏度，對解決農產品和食品中農藥殘留等食品安全問題具有重要意義。

關鍵詞：啶蟲脒；納米金；適配體；酶標儀；檢測

中圖分類號： O657.32文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0324-04

啶蟲脒（acetamiprid）是一種被廣泛使用的煙堿類高效殺蟲劑，具有很強的觸殺、胃毒和內吸殺蟲作用，主要作用于昆蟲神經突觸后膜的乙酰膽堿受體，起到殺蟲作用[1-2]。由于其對于哺乳動物具有較低的毒性，同時與目前常見的有機磷類、氨基甲酸酯類農藥不存在交叉抗性，啶蟲脒在現代農業中被廣泛使用。然而，由于過量使用或不當操作，在農產品或食品中有時會存在一定程度的農藥殘留，特別是在谷物、蔬菜和水中累積的啶蟲脒會對人體健康帶來隱患，對人體外周血淋巴細胞具有一定的毒性，還會誘發DNA損傷；啶蟲脒在水體中的殘留對于水生生物，如魚、蝦、藻類等具有高致毒性，對于家蠶、鳥類、蜜蜂等也有較高的毒性，給環境安全帶來隱患，也給農業帶來較大的損失[3-6]。因此，農產品、食品和水體中啶蟲脒的檢測對于保障食品安全具有重要意義。

目前，常見的檢測啶蟲脒的方法包括高效液相色譜、氣相色譜和酶聯免疫吸附測定法等[7-11]，盡管這些方法可以用于靈敏檢測實際樣品中的啶蟲脒，但是由于所用儀器昂貴，耗時較長，且操作繁瑣，限制了其在食品安全快速檢測中的應用。建立一種快速、靈敏、便捷地檢測食品中啶蟲脒的方法對于保障食品安全很有必要。

適配體是一種經指數富集的配體系統進化技術篩選出的能與待測分子發生特異性相互作用的DNA/RNA片段，由于其合成便利、成本低、易于設計、親和力強、特異性好的優點，被廣泛用于小分子的檢測[12-15]。另一方面，功能化的納米金探針作為一種新型的傳感器，具有易于制備、易于功能化，且具有很好的光學性質等優點，在金屬離子、蛋白質、小分子的檢測中受到人們的日益關注[16-19]。近年來，也有一些報道以適配體功能化納米金為探針對生物分子進行檢測，例如，Luo等利用半胱胺功能化納米金在適配體存在時，加入四環素前后溶液吸收光譜的改變，對四環素進行靈敏檢測[20]；Chen等利用納米金和熒光分子修飾的適配體的相互作用，通過測定溶液熒光光譜的改變實現了對卡那霉素的靈敏檢測[21]；Peinetti等通過測定納米金和適配體相互作用后加入磷酸腺苷時阻抗的變化，實現了磷酸腺苷的靈敏檢測[22]。以上研究都顯示出較好的選擇性和較高的靈敏度，然而，由于實驗中需要用到熒光光譜儀、電化學工作站等儀器，在快速簡便檢測小分子方面存在一定不足，利用實驗室常見的固定波長酶標儀對實際樣品中的啶蟲脒進行快速靈敏檢測具有一定的創新性。

基于啶蟲脒與適配體特異性的相互作用和納米金在分散和聚集狀態時吸收光譜的改變，本研究擬發展一種免標記的新方法，以實現緩沖溶液和實際水樣中啶蟲脒的高選擇性和快速靈敏檢測。

1材料與方法

1.1試劑與儀器

啶蟲脒、異稻瘟凈、硫酸卡那霉素購于Aladdin化學試劑有限公司，赭曲霉毒素A購于新加坡Pribolab公司，二水合氯金酸購于美國Sigma公司，根據文獻[23]選取能與啶蟲脒發生相互作用的適配體（5′-TGTAATTTGTCTGCAGCGGTTCTTGATCGCTGACACCATATTAT GAAGA-3′），并由上海生工生物工程股份有限公司合成純化，使用前溶于去離子水中，試驗用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

溶液紫外-可見光譜掃描使用Varian Cary 100紫外可見光譜儀（美國），溶液630 nm處波長記錄使用Multiscan MK3酶標儀（美國）。

1.2緩沖溶液中啶蟲脒的檢測

粒徑為13 nm的納米金，利用文獻[24-25]方法，使用檸檬酸鈉還原氯金酸溶液法制備。向100 μL納米金溶液中加入終濃度為40 nmol/L的適配體和不同濃度的啶蟲脒后，再加入NaCl溶液，使其終濃度為150 mmol/L，反應10 min，利用酶標儀記錄溶液630 nm處吸光度值。

2結果與討論

2.1傳感器的設計原理

表面包覆有檸檬酸根離子的納米金由于表面所帶的負電荷，相互排斥，在溶液中保持分散狀態，當加入NaCl時，由于NaCl破壞了納米金表面的雙電層，使納米金的穩定性大大降低，從分散狀態轉變為聚集狀態，溶液顏色由紅色轉變為藍紫色，相應的溶液光譜會發生紅移，630 nm處吸光度值也會明顯增加[26]，如圖1所示。當適配體單鏈DNA存在時，納米金表面的檸檬酸根被適配體取代，由于DNA側鏈磷酸基團與納米金非特異性相互作用，使納米金帶負電，當加入一定濃度的NaCl時，納米金可以保持一定的穩定性而不發生聚集，溶液顏色仍為紅色。而當待測物質啶蟲脒存在時，由于啶蟲脒與適配體特異性親和作用，適配體構型發生改變，從納米金表面脫落，再加入NaCl時，納米金會發生明顯聚集，溶液顏色由紅色變為藍紫色。隨待測溶液中啶蟲脒濃度的改變，納米金溶液光譜也逐漸改變[27]，基于此可以方便快捷地檢測溶液中的啶蟲脒。

2.2可行性論證

為驗證試驗的可行性，在納米金探針溶液中加入適配體和不同濃度的啶蟲脒，最后加入不同濃度的NaCl溶液，如圖2所示，當溶液中不含有啶蟲脒時，溶液光譜最大吸收峰位于520 nm處，而當溶液中存在50 nmol/L啶蟲脒時，溶液光譜明顯紅移，520 nm處吸光度降低，而630 nm處吸光度值明顯增大，此現象說明啶蟲脒與適配體的結合使納米金的穩定性降低?；谠撔再|可用于啶蟲脒的檢測。后續試驗為了減少光譜測定時間，簡化操作步驟，選取630 nm作為溶液特征吸收波長，同時使用了能快速（1～2 s）、高通量測定溶液630 nm處吸光度值的酶標儀。

2.3試驗條件的優化

使用免標記法測定啶蟲脒，溶液光譜變化與試驗反應條

件密切相關，包括適配體濃度、NaCl濃度、加入NaCl后反應時間、反應體系的pH值等。為使該傳感器獲得最佳的檢測性能，分別對上述試驗條件進行優化。

試驗結果表明，適配體濃度在40 nmol/L時，如圖3A所示，隨著所加入的NaCl濃度逐漸增加，加入50 nmol/L啶蟲脒前后，納米金溶液在630 nm處吸光度值逐漸產生差異，當NaCl濃度達到150 mmol/L時，加入啶蟲脒前后溶液630 nm處吸光度值存在最大差異，繼續增加NaCl濃度，吸光度值差值逐漸減小。這是由于當NaCl濃度較低時，納米金溶液始終保持較為穩定狀態，納米金呈分散狀態，溶液光譜差異較小，而當NaCl濃度較高時，即使不存在啶蟲脒的競爭性作用，吸附在納米金表面的適配體也不足以維持納米金溶液的分散狀態，即溶液中的納米金已經完全聚集，造成溶液630 nm處吸光度值差異減??；只有在NaCl濃度適中時，由于啶蟲脒的競爭性作用，吸附在納米金表面的適配體脫落，使其穩定性降低，而不存在啶蟲脒的溶液，由于納米金表面的適配體的保護作用，使納米金在加入NaCl后保持分散狀態，溶液630 nm處吸光度值差異最大。同時試驗結果表明，在加入NaCl 5 min后，吸光度值即保持穩定。因此，本試驗選擇40 nmol/L為適配體最佳濃度，150 mmol/L 為最適NaCl濃度，在加畢NaCl后反應5 min，使用酶標儀測定溶液在630 nm處吸光度值。

試驗還對體系pH值進行優化，如圖3B所示，當pH值在5.5～8.5間，溶液在630 nm處吸光度值均比不含有啶蟲脒的溶液吸光度值大，在pH值為 7.5時存在最大差異，這可能是由于不同pH值時，納米金與適配體親和力存在差異，同時不同pH值對納米金穩定性也存在一定影響。后續試驗中，采用pH值為 7.5作為最佳試驗條件。

2.4啶蟲脒的檢測曲線

在最優試驗條件下，考察該傳感器對啶蟲脒的檢測能力。圖4為納米金溶液中含有不同濃度啶蟲脒時630 nm處吸光度值的變化。從圖4可以看出，在0～50 nmol/L濃度范圍內，溶液630 nm處吸光度值隨啶蟲脒濃度的增加而增加，說明隨著啶蟲脒的增加，結合在納米金表面的適配體量逐漸減少，納米金在NaCl存在時的穩定性也逐漸降低。圖4插圖顯示在 2～20 nmol/L范圍內，溶液在630 nm處吸光度值與啶蟲脒濃度線性相關。線性方程為D630 nm=0.272 7+ 0.001 3 Cacetamiprid，相關系數（R2=0.94），傳感器對啶蟲脒檢出限為2 nmol/L。

2.5方法的選擇性

試驗還考察了該傳感器對啶蟲脒的選擇性，結果如圖5所示，在相同試驗條件下，當溶液中存在50 nmol/L赭曲霉毒素A（真菌毒素）、異稻瘟凈（農藥）或卡那霉素（獸藥）時，溶液在630 nm處吸光度值遠遠低于其對于目標分子啶蟲脒的響應，表明該傳感器對啶蟲脒有著較高的選擇性，該方法有很好的特異性。

2.6實際樣品的檢測

為了驗證該免標記傳感器的實用性，本研究對實際水樣（取自校園湖水）加標，進行啶蟲脒的回收率試驗。在測定前，水樣首先用0.45 μm孔徑的濾芯過濾以去除其中的固體雜質，再利用本研究所建立的方法，在最優化條件下對啶蟲脒進行定量分析，表1結果表明，當加入的啶蟲脒在5～20 nmol/L 時，回收率為90%～109%，RSD低于9%，說明該傳感器能夠用于實際樣品中啶蟲脒的檢測。

3結論

本研究利用啶蟲脒[28]與其適配體特異性的相互作用以及納米金優異的光學性質，構建了一種快速、靈敏檢測溶液中啶蟲脒的方法，具有較好的靈敏度和特異性，操作簡便，有望用于農產品或食品安全的快速分析。

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