微波輔助提取常春油麻藤花總黃酮工藝及其抗氧化性

楊申明+楊紅衛+王振吉++范樹國+謝正萍

摘要：為了優化微波輔助提取常春油麻藤花總黃酮的提取工藝，并測定其總黃酮的抗氧化性。采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量，通過正交試驗L9（34）優化其總黃酮的提取工藝參數，并就總黃酮對1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）、羥基自由基（·OH）和超氧陰離子自由基（O-2[KG-2]· [KG-3]）的清除能力進行初步研究。結果表明：總黃酮最佳提取工藝參數為乙醇體積分數75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波時間3.5 min，微波功率200 W，在此條件下，總黃酮的平均提取率為19.77%；微波輔助提取的常春油麻藤花總黃酮具有較強的抗氧化性，對DPPH·、羥基自由基和超氧陰離子自由基清除作用明顯，且其質量濃度與抗氧化活性呈一定的量效關系。

關鍵詞：常春油麻藤花；微波輔助提??；總黃酮；抗氧化性

中圖分類號： R151.3文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0366-04

常春油麻藤（Mucuna sempervirens Hemsl）為蝶形花科（Papilionaceae）常春油麻藤屬植物，別稱牛馬藤、油麻藤子、綿麻藤[1]，在我國主要分布在四川、貴州和云南等地[2]，它是一種藥食同源植物，其藤莖、花和種子具有活血、通經活絡之功效，常用于風濕疼痛、四肢麻木、血虛貧血、月經不調等病癥，具有很好的療效[1]。常春油麻藤產花量很多，云南楚雄每年2—5月采花炒食、做湯制作蔬菜食用，風味獨特，是當地很受歡迎的一道特色野菜。因此，常春油麻藤花在醫藥和食品工業領域中具有廣泛的利用價值。

目前，國內外對常春油麻藤花的研究主要集中在揮發性成分[3]、黃酮類結構鑒定、抗氧化活性成分[4]及抗氧化活性成分提取分離[5]等方面，其他有關常春油麻藤花的研究鮮見報道。近年來，黃酮類化合物越來越多的生物活性被不斷發現，其應用范圍正逐步擴大，但對常春油麻藤花中總黃酮含量測定及提取工藝的研究未見報道。本研究采用微波輔助提取常春油麻藤花中總黃酮，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法測定總黃酮含量，通過正交試驗L9（34）優化提取工藝。同時，以維生素C為對照，并就所提取的總黃酮對DPPH·、羥基自由基和超氧陰離子自由基的清除作用進行研究，旨在為常春油麻藤花的綜合利用提供依據和參考。

1材料與方法

1.1材料與儀器

常春油麻藤花采自云南省楚雄市，經鑒定為蝶形花科常春油麻藤屬植物；蕓香苷標準品由中國藥品生物制品檢定所生產，1，1-苯基-2-苦肼基自由基（DPPH·）由上海藍季科技發展有限公司生產，維生素C由昆山譜森實驗室用品科技有限公司生產，其他所用化學試劑均為分析純，由天津市風船化學試劑廠生產。

主要儀器：UV-2100型紫外分光光度計，上海尤尼柯儀器有限公司；G80F23CN3P-Q5（QO）型微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司；SE40ZF型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司；HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市大地自動儀器廠；SHZ-ⅢA型循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；202-00型干燥箱，上海市崇明實驗儀器廠。

1.2試驗方法

1.2.1標準曲線繪制

采用蕓香苷作標準品，用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH[JP3]顯色法繪制標準曲線，在502 nm[6]波長處測吸光度，以質量濃度（C）對吸光度（D）進行線性回歸，得回歸方程 D=7.996 4C+0.002 9，r2=0.999 5。結果表明蕓香苷質量濃度在0～0.040 mg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

1.2.2常春油麻藤花總黃酮提取方法

工藝流程：新鮮常春油麻藤花→洗凈風干后置于50 ℃干燥箱烘干→粉碎過40目→用石油醚去除色素和油脂→烘干→得去除色素和油脂的常春油麻藤花干粉（備用）→稱量→微波提取→抽濾→定容→測定總黃酮含量。

操作方法：準確稱取1.0 g去除色素和油脂的常春油麻藤花干粉，加入乙醇溶液，置于微波中提取，提取完畢后抽濾，濾液定容至50 mL容量瓶中，按標準曲線繪制方法顯色，在502 nm波長處測樣品溶液吸光度，總黃酮提取率按式（1）計算。

[JZ（]提取率=C×N×V/m×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：C表示根據回歸方程計算出的黃酮質量濃度，mg/mL；N表示稀釋倍數；V表示提取液體積，mL；m表示常春油麻藤花干粉質量，g。

1.2.3單因素試驗設計

采用微波輔助進行提取，分別考察以下單因素的影響：（1）乙醇體積分數采用55%、65%、75%、85%、95%的條件下進行比較，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波時間3.0 min，微波功率200 W；（2）料液比采用1 g ∶[KG-3]20 mL、1 g ∶[KG-3]30 mL、1 g ∶[KG-3]40 mL、1 g ∶[KG-3]50 mL、1 g ∶[KG-3]60 mL 的條件下進行比較，乙醇體積分數75%，微波時間3.0 min，微波功率200 W；（3）微波時間采用2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min的條件下進行比較，乙醇體積分數75%，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波功率200 W；（4）微波功率采用100、200、300、400、500 W的條件下進行比較，乙醇體積分數75%，料液比1 g ∶[KG-3]40 mL，微波時間3.0 min，從而確定各因素的影響作用。

1.2.4正交試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇乙醇體積分數、料液比、微波時間、微波功率進行4因素3水平作 L9（34） 正交試驗優化提取條件，因素水平設計，見表1。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

在料液比 1 g ∶[KG-3]40 mL、微波時間3.0 min、微波功率200 W的條件下，探究不同乙醇體積分數55%、65%、75%、85%、95%對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響，結果見圖1。由圖1可知，當乙醇體積分數從55%增大至75%時，總黃酮提取率由12.06%增加至19.21%；當乙醇體積分數從75%增大至95%時，總黃酮提取率由19.21%減小至9.59%。因此，最佳乙醇體積分數在75%附近，選乙醇體積分數65%～85%優化試驗。

2.1.2料液比對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數75%、微波時間3.0 min、微波功率200 W的條件下，探究不同料液比1 g ∶[KG-3]20 mL、1 g ∶[KG-3]30 mL、1 g ∶[KG-3]40 mL、1 g ∶[KG-3]50 mL、1 g ∶[KG-3]60 mL 對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響。由圖2可知，當料液比從1 g ∶[KG-3]20 mL增大至1 g ∶[KG-3]40 mL時，總黃酮提取率由13.47%增加至19.24%；[JP3]當料液比從1 g ∶[KG-3]40 mL增大至1 g ∶[KG-3]60 mL時，總黃酮提取率由19.24%減小至1729%。因此，最佳料液比在1 g ∶[KG-3]40 mL附近，選料液比1 g ∶[KG-3]30 mL～1 g ∶[KG-3]50 mL優化試驗。

[CM（26]2.1.3微波時間對總黃酮提取率的影響

75%、料液比1 g ∶[KG-3]40 mL、微波功率200 W的條件下，探究不同微波時間2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 min對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響。由圖3可知，當微波時間從2.0 min延長至3.0 min時，總黃酮提取率由13.66%增加至19.24%；當微波時間從3.0 min延長至4.0 min時，總黃酮提取率由1924%減小至13.36%。因此，最佳微波時間在3.0 min附近，選微波時間2.5～3.5 min優化試驗。

2.1.4微波功率對總黃酮提取率的影響

在乙醇體積分數75%、料液比1 g ∶[KG-3]40 mL、微波時間3.0 min的條件下，探究不同微波功率100、200、300、400、500 W對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響。由圖4可知，當微波功率從100 W增大至200 W時，總黃酮提取率由17.50%增加至19.20%；當微波功率從200 W增大至500 W時，總黃酮提取率由19.20%減小至12.66%。因此，最佳微波功率在200 W附近，選微波功率100～300 W進行優化試驗。

2.2正交試驗結果

由表2可知，對常春油麻藤花總黃酮提取率的影響因素由大[CM（25]到小為乙醇體積分數>料液比>微波時間>微波功率。由[CM）]

極差分析得出最佳工藝條件為A2B1C3D2，即乙醇體積分數75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波時間3.5 min，微波功率200 W。在最佳工藝條件對常春油麻藤花總黃酮進行提取，重復5次，得到總黃酮平均提取率為19.77%（大于正交試驗結果中的最高提取率19.62%），相對標準差RSD值為1.32%，表明該方法重現性良好，可用于常春油麻藤花中總黃酮的提取。

2.3常春油麻藤花總黃酮抗氧化性分析

2.3.1清除DPPH·的能力評價

DPPH·是一種以氮為中心的穩定自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波長517 nm處有強吸收峰，當有自由基清除劑存在時其溶液顏色變淺，且溶液褪色程度與清除劑的清除能力及數量呈正相關。因此，可根據褪色程度來間接評價其抗氧化劑的抗氧化性[12]。由圖5-A 可知，常春油麻藤花總黃酮質量濃度在0.003 9～0.062 8 mg/mL 范圍內，隨質量濃度增大，清除DPPH·能力增強，當總黃酮質量濃度為0.062 8 mg/mL，清除率最大為82.83%。與同質量濃度維生素C相比，總黃酮清除DPPH·能力稍弱于維生素C（96.33%），但常春油麻藤花總黃酮依然表現出較強的清除DPPH·的能力。

2.3.2清除·OH的能力評價

羥基自由基是活性氧中對生物體危害最大、毒性最強的一種自由基，能與細胞中的分子發生反應，對機體造成損傷，清除羥自由基的能力是評價抗氧化物的重要指標[13-14]。由圖5-B可知，常春油麻藤花總黃酮質量濃度在0.003 9～0.062 8 mg/mL范圍內，隨質量濃度增大，清除羥基自由基能力增強，當總黃酮質量濃度為 0.062 8 mg/mL，清除率最大為85.36%。與同質量濃度維生素C相比，總黃酮清除羥基自由基的能力稍弱于維生素C（9414%），但常春油麻藤花總黃酮也表現出較強的清除羥基自由基的能力。

2.3.3清除O-2[KG-2]· [KG-3]的能力評價

超氧陰離子自由基可通過鄰苯三酚在堿性條件下發生自氧化產生，并生成一種帶有顏色的中間產物，該有色中間產物在325 nm波長處有特征吸收峰。當加入O-2[KG-2]· [KG-3]清除劑時，O-2[KG-2]· [KG-3]的生成受到抑制，鄰苯三酚自氧化過程受阻，溶液在325 nm處吸收減弱。所以，可通過測定325 nm處吸光度推斷清除劑對O-2[KG-2]· [KG-3]的清除率[15-16]。由圖5-C可知，常春油麻藤花總黃酮質量濃度在0.0039～0.062 8 mg/mL 范圍內，隨質量濃度增大，清除超氧陰離子自由基能力增強，當總黃酮質量濃度為0.0628 mg/mL，清除率最大，為70.95%。與同質量濃度維生素C相比，總黃酮清除超氧陰離子自由基的效果與維生素C（72.51%）很接近，表明常春油麻藤花總黃酮具有很強的清除羥基自由基的能力。

3結論與討論

微波輔助提取常春油麻藤花總黃酮中，影響總黃酮提取效果的因素從強到弱依次為乙醇體積分數>料液比>微波時間>微波功率。經過優化后的提取工藝參數為乙醇體積分數75%，料液比1 g ∶[KG-3]30 mL，微波時間3.5 min，微波功率200 W。在該條件下進行驗證性試驗，重復5次，得到常春油麻藤花總黃酮平均提取率為19.77%，相對標準差RSD值為1.32%。該提取方法快速省時、操作簡單、重復性好，可用于常春油麻藤花中總黃酮的提取和含量測定。

該研究從DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的清除能力3個方面來評價常春油麻藤花中總黃酮抗氧化性?？寡趸栽囼灲Y果表明，在常春油麻藤花總黃酮質量濃度0.003 9～0.062 8 mg/mL范圍內，隨質量濃度的增大，清除DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的能力增強。當總黃酮質量濃度為 0.062 8 mg/mL 時，對DPPH·、·OH和O-2[KG-2]· [KG-3]自由基的清除率最大分別為82.83%、85.36%和70.95%，表明常春油麻藤花總黃酮具有較強的抗氧化能力。因此，常春油麻藤花可作為一種良好的抗氧化物質資源進行開發利用。

本研究結果表明，常春油麻藤花中富含黃酮類物質，該黃酮類物質具有較強的抗氧化性，是一種具有較大開發價值的藥食同源植物，相關研究結果對常春油麻藤花中黃酮類物質的提取及抗氧化活性成分的研究具有重要意義。但常春油麻藤花中黃酮類物質發生抗氧化作用的機理目前還不清楚，有待進一步深入研究。

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