提高CRISPR/Cas9系統靶向編輯效率方法的研究進展

趙盼盼+王麗+袁園園

摘要：近年來，CRISPR/Cas9系統經過一系列改造后已成為繼鋅指核酸酶ZFNs和TALENs后的新型高效定點編輯的新技術，目前，該技術已成功應用于人類細胞、斑馬魚、小鼠以及細菌的基因組精確編輯，但是該技術在農作物等植物中的應用還比較受限，且其脫靶效應等問題還有待解決。本文首先簡要綜述了CRISPR/Cas9系統的發展歷程、結構組成和作用機制及其在農作物中的應用，進而綜述了近年來探索出的提高CRISPR/Cas9系統靶向編輯效率的方法。最后，對基因組編輯技術在農作物和作物育種上的應用進行了展望。

關鍵詞：CRISPR/Cas9系統；向導RNA；脫靶效應；農作物

中圖分類號：S188 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0012-04

基因組編輯技術產生于20世紀80年代，在CRISPR/Cas出現之前，科學家們只能通過對龐大的突變體庫進行篩選，或通過同源重組途徑來對DNA進行編輯。由于細胞發生隨機同源重組的效率只有百萬分之一，用同源重組方法進行基因編輯耗時長、成本高，因此限制了基因組編輯技術的廣泛應用[1-2]。21世紀初，科研人員相繼開發出鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，簡稱ZFNs）技術和類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator-likeeffector nucleases，簡稱TALENs）技術，基因組編輯技術得到迅速發展[3]。2013年初，《Science》《Nature》《Biotechnology》《Cell》等雜志幾乎同時報道了1種不依賴于FokⅠ核酸酶的基因組編輯技術——clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9（CRISPR/Cas9），CRISPR/Cas9技術具有多個選擇的靶向基因的位點，可實現多基因編輯，編輯的類型包括基因的定點插入、小片段的缺失、多個位點同時突變、基因定點的插入/缺失indel突變等。與其他靶向編輯技術相比，還具有精確可靠、設計簡單、容易操作、成本低廉等優點。CRISPR/Cas9技術突破了基因編輯的瓶頸，為基因編輯提供了一把精確的“手術刀”。該技術從發現至今發展迅速，正在成為基因改造的重要方法。

1 發展簡史

1987年日本大阪大學（Osakua University）學者Ishino在研究大腸桿菌堿性磷酸酶基因時，發現該基因附近有1段由簡單重復序列組成的特異序列[3]。隨后，研究者們在其他物種也發現了類似序列，并給予了各種不同的命名：直接可變重復（direct variable repeat，簡稱DVR），串聯重復（tandem repeat，簡稱TREP），長串聯重復的重復（long tandemly repeated repetitive，簡稱LTRR），長串串聯重復（long clusters of tandem repeats，簡稱LCTR），間隔穿插直接重復（spacers interspersed direct repeats，簡稱SPIDR）[4]。Mojica等在2000年提出把類似序列作為重復序列家族的一類成員，并將其命名為規律的短間隔序列（short regularly spaced repeats，簡稱SRSRs）。2002年，荷蘭學者Jansen分析該序列發現：它由長度不一（21～37 bp）的正向重復序列（repeats）與長度類似的間隔序列（spacers）間隔排列而成，并將其命名為成簇的、規律間隔的短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，簡稱CRISPRs），并在其附近發現CRISPR相關（CRISPR-associated，簡稱Cas）基因，分析發現Cas基因表達產物與DNA解螺旋酶及核酸酶具有高度同源性，提示Cas蛋白具有DNA內切酶功能。到了2005年，有3個研究小組發現CRISPR可能與微生物的免疫作用有關。2007年，Barrangou等首次利用試驗證明了嗜熱鏈球菌的CRISPR系統直接參與細菌對噬菌體的適應性免疫反應。2012年，Jinek等對細菌的Ⅱ型CRISPR系統進行改造和優化，成功地在體外定點切割了環狀質粒DNA和線性寡聚核苷酸片段，并證明將分開作用的crRNA、tracrRNA通過1段linker連接成1條單一向導RNA（single-guide RNA，簡稱sgRNA），仍然能高效地介導Cas9蛋白對DNA的定點切割。近年來CRISPR/Cas9系統被應用到真核生物中，引起了一場遺傳操作的革命性改變。2013年，麻省理工學院張鋒團隊和哈佛大學Church團隊在《Science》雜志上同時發表了CRISPR/Cas9系統在哺乳動物細胞中的應用，多個靶向sgRNAs可以同時對基因組的多個位點進行識別，并通過Cas9作用產生斷裂，通過DNA修復系統的不精確修復在多個斷裂點周圍同時引發突變，從而使之作為一種基因編輯方法投入應用。2014年，Nishimasu等解析了Cas9、sgRNA和DNA復合體的晶體結構，為CRISPR/Cas9技術的進一步改進提供了研究條件[3]。CRISPR/Cas9系統介導的基因組編輯，是繼ZFNs、TALENs后的第3代基因組編輯技術。該技術已在擬南芥、煙草、高粱和水稻等多個物種中實現了基因組編輯[5]。鑒于此，CRISPR/Cas9技術展現出了廣闊的應用前景，并受到眾多分子生物學家的青睞，但該技術的脫靶效應是基因靶向過程中受到廣泛關注的一個重要問題，因此如何改善和提高基因組編輯效率，同時最大限度降低脫靶風險成為了亟待解決的問題。

2 CRISPR/Cas9的組成、結構及作用機制

CRISPR基因座結構包括5′端的tracrRNA（trans-activating crRNA）基因，中間是一系列Cas蛋白編碼基因（包括Cas1、Cas2、Csn2和Cas9等），3′端由啟動子區域、大量spacers、repeats順序構成。CRISPR上游的前導序列啟動CRISPR序列的轉錄，轉錄產物為precrRNA，接下來precrRNA在Cas9和核酸酶的作用下被剪切為成熟的crRNA，crRNA以堿基互補配對的方式與tracrRNA結合為tracrRNA：crRNA復合體，tracrRNA：crRNA復合體與Cas9核酸酶形成RNA-蛋白質復合體，由crRNA中的特異性序列引導至臨近前體間隔序列毗鄰基序（protospacer adjacent motif，簡稱PAM）的靶位點，crRNA中的引導序列與靶位點DNA堿基互補配對結合并啟動Cas9核酸酶切割DNA雙鏈，Cas9蛋白的HNH核酸酶結構域剪切互補鏈，而Cas9的RuvCI結構域剪切非互補鏈，進而在靶位點產生DNA雙鏈斷裂（DNA double strand break，簡稱DSB），然后利用細胞的非同源性末端連接（non-homologous endjoining，簡稱NHEJ）或同源重組（homologous recombination，簡稱HR）修復機制對斷裂的DNA進行插入、缺失（Indel）、修復（Repair）或替換（Replacement）。與ZFNs、TALENs相比，CRISPR/Cas9技術的優勢是可針對多個基因設計sgRNA并在1次打靶中同時完成多基因編輯。根據Cas9可多位點同時打靶的特點，在待刪除片段兩端設計sgRNA，1次打靶便可實現片段的定向刪除，這一特點可滿足基因簇刪除、多基因刪除、調控區域刪除、外源標記基因的大片段刪除等的需求[6]。

3 提高CRISPR/Cas9靶向效率的方法

自CRISPR/Cas9編輯技術投入使用至今，研究者們一直在探索提高該技術靶向效率的方法。有研究者指出，通過調節Cas9核酸酶和sgRNA濃度可降低脫靶風險，但濃度降低后，相應基因組編輯能力會減弱[7]。Zhang等分別通過定性、定量的方法系統地比較了PAM對基因組編輯效率的影響，并發現編輯效率依次是NGG>NGA>NAG（N=A、T、C或G）[8]?？紤]到細胞在DNA修復過程中NHEJ、HDR是2個相互拮抗的過程，多個研究組通過體外篩選找到小分子化合物對NHEJ過程進行抑制，從而達到了增強HDR過程提高定點敲入效率的目的。Maruyama等通過小分子抑制劑Scr7抑制NHEJ修復途徑中的連接酶Ⅳ，大大提高了HR效率，為HR介導的基因組編輯更廣泛地應用奠定了基礎[9-10]。CRISPR/Cas9的脫靶效應在研究中造成的諸多不確定性，無疑制約了該技術的廣泛應用。脫靶率的高低不僅取決于不同的基因編輯平臺（目前對于各種基因組編輯平臺脫靶率的比較還沒有確切的結論），也同樣受靶向序列、細胞類型、基因編輯工具在細胞內的表達時間和強度、載體的選擇以及脫靶率的檢測方法等影響。筆者主要從提高sgRNA的特異性、改造Cas9蛋白結構以及載體的選擇與構建3個方面介紹了提高CRISPR/Cas9技術靶向效率的方法。

3.1 提高sgRNA的特異性

靶向sgRNA的設計對于DNA片段的編輯效率尤為重要。由于sgRNA載體設計的簡易性，研究者可針對1個基因設計多個sgRNA，并可結合陣列試驗構建sgRNA文庫用于功能基因篩選。有關sgRNA文庫設計的相關綜述詳見謝勝松等的報道[11]。2012年，Jinek等將CRISPR/Cas9系統中crRNA、tracrRNA 2個非編碼RNA改造成1個RNA，即sgRNA，它能夠指導Cas9蛋白對特定的DNA序列進行靶向斷裂，為CRISPR/Cas9系統的廣泛應用奠定基礎[3]。靶向sgRNA序列可以選擇GC含量高一些的序列，盡量使堿基分布均勻，靶點盡量選擇在DNA超敏位點，這樣可以更好地實現Cas9對DNA片段的切割[12]。Doench等系統性研究了CRISPR/Cas9系統介導的基因組編輯效率，并對1 841條sgRNA進行比較，發現若sgRNA的3′末端第20位堿基為G和第16位堿基為C時，基因組編輯效率較高，若第20位堿基為C、第16位堿基為G時，則基因組編輯效率低；若sgRNA第3位堿基為A，其基因組編輯效率比該位置為C時高；若第18、19位堿基為T，其基因組編輯效率則相對較低[13]。這一研究為設計高效的sgRNA提供了強大的實驗數據支持。還有的研究者發現在sgRNA的5′端額外增加2個G后能夠顯著提高CRISPR/Cas9系統的特異性[14]。此外，也有研究者嘗試縮短sgRNA的長度來提高其特異性，Fu等使用17～18 nt的“truncated sgRNA”進行基因打靶發現不會影響其活性，但可顯著降低脫靶風險[15]。

3.2 通過改造Cas9蛋白結構降低脫靶效應

為降低CRISPR/Cas9系統的脫靶效應，有的研究者對野生型的Cas9進行了改造，使其中1個結構域失活，并得到突變型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶。野生型的Cas9蛋白有2個內切酶活性結構域，而Cas9的其中1個結構域失活只能切割DNA單鏈，產生1個單鏈切口，Cas9蛋白經過這一改造，CRISPR/Cas9技術應用時就需要設計2條sgRNA，2條sgRNA分別結合不同的DNA鏈，突變體切口酶D10A Cas9或H840A Cas9會在每個sgRNA結合的地方造成單鏈缺口，2個相鄰的單鏈切口會形成1個DSB。這種單鏈切口酶的優點在于，如果1條sgRNA發生錯配，只會形成1個切口，不會形成DSB，這種情況下細胞會自動將其修復正常；如果2條sgRNA同時錯配，那么形成雙鏈斷裂的脫靶幾率會很小，這就極大地提高了靶點的專一性。張鋒課題組用這一方法對靶向DNA進行切割，發現該策略可使脫靶效應降至1/1 000[3]。另有研究指出，將該方法和適當縮短sgRNA的靶標序列相結合，能夠進一步降低脫靶效應[15]。隨后，研究者將Cas9蛋白的核酸酶結構域突變，產生失活的dCas9，然后將dCas9與FokⅠ核酸酶結合形成融合蛋白（FokⅠ-dCas9），發現只有當2個融合蛋白單體彼此靠近并形成二聚體時才能行使切割功能，簡單過程是2個sgRNA分別引導dCas9-FokⅠ結合到相距15～20 bp的靶DNA區域，FokⅠ實現二聚化而被激活，對中間的DNA序列進行切割，產生雙鏈末端斷裂。Tsai等報道了dCas9-FokⅠ融合蛋白可有效降低CRISPR的脫靶效應至1/5 000[16]。此外，研究者還對Cas9蛋白進行適當的修飾（如加上信號肽，或標簽蛋白）[17-19]，用來提高基因組編輯效率。

3.3 選擇構建合適的載體

如何有效地將CRISPR/Cas9基因組編輯質粒準確地靶向運輸到特定的細胞、組織和器官中，實現精確導向的基因編輯，也是提高CRISPR/Cas9靶向效率應考慮的重要因素，尤其在基因治療領域成為了當今一大難題。在體外對一些細胞進行基因組編輯，可以用電穿孔或病毒載體將CRISPR/Cas9基因組編輯質粒轉入細胞之中。電穿孔的方法進行基因轉染對細胞的損傷較大，這些細胞在體外經過電穿孔處理后，細胞的活力可能會降低，回輸到體內后達不到理想的效果。病毒載體如逆轉錄病毒載體、慢病毒載體、腺病毒載體等在體外應用比較廣泛[20-21]。將CRISPR/Cas9基因編輯系統與腺病毒（adeno-associated virus，簡稱AAV）系統相結合，成功地對小鼠腦細胞進行了基因編輯，還構建了肺腺癌小鼠模型。也有報道利用AAV遞送CRISPR/Cas9基因編輯系統，成功地對小鼠腦部神經細胞的多個基因進行編輯，并觀察到了小鼠行為上的變化[22]。此外，納米顆粒和脂質體也是一種頗具前景的遞送工具[23-24]。在農作物等植物中，則載體的選擇比較單一，一般會構建含有分別驅動Cas9（如35S）、sgRNA（如：U6或U3）表達的啟動子序列、密碼子優化的Cas9以及設計好的sgRNA的表達載體，可以將Cas9、sgRNA構建到同一表達載體，也可以構建為不同的表達載體。Upadhyay等在煙草細胞中比較了sgRNA、Cas9核酸酶構建到同一個載體或分別構建到不同的2個載體表達對突變效率的影響，結果表明，在構建到同一載體中表達的突變效率顯著高于分別構建到不同載體中表達的突變效率[19]。

4 CRISPR/Cas9系統在農作物中的應用

為了檢測CRISPR/Cas9系統能否應用于植物細胞，Orel等設計Gateway雙元T-DNA表達載體來共表達Cas9、sgRNA，利用外源報告基因DGU.US研究CRISPR/Cas9系統在水稻的愈傷組織中能否產生雙鏈DNA斷裂。結果發現當CRISPR/Cas9系統、DGU.US報告基因共轉化到水稻的愈傷組織時，在愈傷組織上發現GUS的著色點，而只有報告基因轉入的愈傷組織上則無GUS著色點[25]。由此可知，CRISPR/Cas9系統能夠在植物細胞中產生雙鏈DNA斷裂，這是該系統在動物、人之后成功應用于植物中進行外源基因編輯，并且明顯簡化了試驗過程。我國學者利用CRISPR/Cas9技術成功剔除了1個基因，使小麥獲得白粉病抗性，進而在小麥抗病關鍵生物技術領域取得重要進展，并第1次在1個多倍體物種中證明了可以對多個部分同源的基因同時并準確進行編輯，而在水稻上使4個基因功能失活的試驗，則意味著該技術可以用于水稻這種重要農作物的改良[17，26]。此外，該技術在玉米、高粱、甜橙、大豆、馬鈴薯、番茄等農作物中均實現了基因的定點編輯甚至多位點的精確編輯[27-28]。但在這些農作物中只有水稻得到了穩定的突變體植株，其余物種均是通過原生質體或者葉片注射等瞬時驗證系統證明了CRISPR/Cas9系統在植物細胞中的可行性[29]。

5 展望

CRISPR/Cas9作為一種新型的基因靶向修飾技術，雖然其應用尚處起步階段，但相比于ZFNs、TALENs技術的耗時、耗力以及設計繁瑣等缺點而言，CRISPR/Cas9以其設計簡單、耗時短、試驗操作性強等優勢而備受科研人員青睞。2014年初，《Nature Methods》將TALENs和CRISPR/Cas9技術評為2014年值得關注技術，但同時也明確指出了CRISPR/Cas9的脫靶現象，我們相信隨著科研人員對改善脫靶效應方法的不斷探索研究，不久的將來CRISPR/Cas9系統將更好地幫助研究者們了解基因的功能，探索基因組的奧秘。除了應用于植物功能基因組研究，基因組編輯技術還可以應用于農作物品種改良[30]，便于育種工作者加快培育更優質、高產、多抗性的農作物優良品種。例如：通過基因組編輯技術將花粉或花藥發育相關的基因進行定點突變，可以人工創制隱性核雄性不育材料，進一步用于農作物雜種優勢的利用。如何改造該技術及供體基因載體的設計，利用HDR在基因組特定位點引入功能基因，這將是今后CRISPR/Cas9技術重點發展的方向，一旦獲得突破必將使該技術在農作物改良方面起到更大的作用。除了技術方面仍存在的問題（例如如何更完善地提高靶向效率，更精確地脫靶效應評估體系的研發等），作物育種方面面臨的最大問題在于通過該技術產生的植物和相關產物是否受轉基因相關法律約束，這更引發了知識產權保護和法律、社會倫理等諸多領域問題的思考?？傊?，CRISPR/Cas9技術在農作物中的應用，既是機遇又充滿了挑戰。

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