海南冬青組培快繁體系的建立

姚紹嫦+譚文明+藍祖栽

摘要：建立海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）的組培快繁技術體系。以海南冬青成熟種子為材料，以MS、1/2MS為基本培養基，采用正交試驗設計法研究不同植物生長調節劑組合對海南冬青種子萌發、初代誘導、增殖培養、生根培養的影響，篩選出組培快繁各環節的最佳培養基配方。研究結果，海南冬青種子萌發的最佳培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L，萌發率達90%以上；叢生芽誘導的最適培養基為MS+6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導不定芽數為28.56個；最佳繼代增殖培養基為MS+6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L，20 d增殖系數為7.30；最適的生根培養基為1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L，生根率為91.33%，在菜園土-細河沙（3 ∶1）中移栽成活率為90%。表明本組培快繁技術體系不但增殖系數高，而且組培苗質量好，可為海南冬青的規?；a提供優質種苗與技術指導。

關鍵詞：海南冬青；組培快繁；叢生芽；正交試驗

中圖分類號：S567.1+90.43 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0022-04

海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）為冬青科冬青屬常綠小喬木，其干燥葉加工炮制而成的廣西少數民族民間草藥山綠茶，被收載于《廣西中藥材標準》（1990年版）[1]，具有清熱解毒、消腫止痛、活血通脈的功效，主要用于降血壓、降血脂、降膽固醇以及治療冠心病、腦血管意外所致的偏癱、風熱感冒、肺熱咳嗽、咽喉水腫、扁桃體炎、痢疾等病癥[2]。以山綠茶為主要原料制成的制劑作為降壓、降脂的常用中成藥，具有使用量較大、療效確切、毒副作用小、產品獨特等優點，在廣西等地區市場占有率高，有較好的經濟效益與發展前景。山綠茶是山綠茶降壓片、決明山綠茶、山綠茶降壓膠囊等產品的主要原料，其中山綠茶降壓片已被收載于中藥部頒標準（標準編號：WS3-B-2838-98）。目前，山綠茶以采集野生資源為主，隨著近年來需求量的不斷上升，野生資源已瀕臨滅絕，難以滿足制藥企業的需求[3]，迫切需要開展人工栽培，但目前對山綠茶的研究主要集中在其制劑的臨床療效[4-5]、含量測定和炮制方法[6-7]、化學成分與藥理活性[8-9]等方面，迄今尚未發現海南冬青有關組織培養方面的研究報道。在自然狀態下，海南冬青主要依靠種子繁殖，由于果實經常在成熟期被鳥類啄食而造成種子大量損失，以及種子具有休眠特性，在自然狀態下萌發率低而導致種子繁殖速度緩慢。為了更好地開發和利用海南冬青，本研究通過組培快繁的技術手段，建立組培快繁的技術體系，為開展海南冬青的規?；斯ぴ耘嗵峁﹥炠|種苗與技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料

海南冬青的成熟漿果于2014年10月采自廣西南寧地區武鳴縣大明山風景區，標本經廣西中醫藥研究院鑒定為海南冬青（Ilex hainanensis Merr.）。

1.2 方法

1.2.1 外植體選擇與滅菌 在海南冬青果實成熟期（每年10—12月），選取完全成熟的紅色漿果，將果皮搓爛，流水沖洗果皮，挑選沉淀的種子作為外植體進行滅菌。在超凈工作臺上，用紗布袋將種子包好，用75%乙醇（體積分數）浸泡紗布袋5～10 s后，再用0.1% HgCl2水溶液（質量分數）分別浸泡6、8、10、12 min滅菌種子，用無菌水搖蕩洗滌4次，用鑷子打開紗布袋，再用無菌吸水紙將種子表面水分吸干后，將種子夾起接種到種子萌發培養基上培養。接種后15 d統計污染情況。

1.2.2 種子萌發培養 將種子接種到含不同質量濃度6-BA與GA3組合的種子萌發培養基上，每處理10瓶，每瓶10粒種子，記錄種子萌發情況，30 d后統計種子萌發率，篩選出適合打破休眠促進萌發的培養基。

1.2.3 初代誘導培養 將萌發的幼苗切取含2片真葉的不定芽進行叢生芽誘導培養，采用L9（34）正交試驗，在MS基本培養基上以6-BA（A）（1.0、2.0、3.0 mg/L）、KT（B）（0.5、1.0、1.5 mg/L）、NAA（C）（0.1、0.2、0.5 mg/L）3種不同類型的生長調節劑的3個水平進行正交試驗，對海南冬青叢生芽誘導培養基進行優化，每種培養基20瓶，每瓶接種3個芽，30 d 統計不定芽誘導數量，比較不同組合誘導不定芽的差異，篩選出適合的初代誘導培養基。

1.2.4 繼代增殖培養 將初代培養獲得的叢生芽切下單個芽進一步轉接到繼代培養基中進行增殖培養，以MS為基本培養基，添加不同質量濃度6-BA（2.0、2.5、3.0 mg/L）、KT（0.50、0.75、1.00 mg/L）、NAA（0.1 mg/L）組合，每處理10瓶，每瓶3個芽，觀察記錄芽的生長情況，20 d統計增殖情況，計算芽增殖系數，篩選出繼代增殖的最佳培養基。

1.2.5 生根培養 切取長約2 cm的不定芽為生根材料，在1/2MS基本培養基上，添加不同質量濃度NAA（0、0.2、0.5 mg/L）與IBA（0、0.50、0.75、1.00 mg/L）組成10個處理，每處理10瓶，每瓶5個芽，20 d統計不同處理的生根率與平均生根數，考察2種生長素組合對生根的影響。

1.2.6 培養條件 培養基均附加3.0%蔗糖和0.5%瓊脂，pH值5.8～6.0，配制分裝后，于121 ℃滅菌20 min。培養條件為26 ℃、光照強度2 000 lx、光照時間10 h/d。

1.2.7 煉苗移栽 待組培苗生根培養30 d后進行煉苗移栽，將瓶蓋打開煉苗3～5 d，然后用鑷子將瓶苗取出，用流水洗去粘在根部的瓊脂，移栽到經過消毒的泥炭土、河沙、菜園土、泥炭土-河沙（3 ∶1）、菜園土-河沙（3 ∶1）5種不同基質上，移栽后用遮陽網遮陰，覆膜保濕，視生長情況逐漸撤去薄膜，20 d時統計不同基質的移栽成活率。

1.3 數據統計與分析

試驗所得數據用Excel和SPSS17.0方差分析軟件處理。

萌發率=30 d后萌發種子數/接種種子數×100%；芽增殖系數=（20 d后不定芽數量-接種時不定芽數量）/接種時不定芽數量；生根率=生根苗數/接種苗數×100%；平均生根數=總生根數/接種總數；成活率=成活苗數/移栽苗數×100%。

2 結果與分析

2.1 外植體滅菌時間篩選

用0.1% HgCl2溶液對海南冬青種子進行滅菌，從表1可以看出，用0.1% HgCl2溶液滅菌10 min以上，效果較好，成功率顯著高于用0.1% HgCl2溶液滅菌時間少于10 min的處理，成功率達95%。HgCl2作為一種滅菌劑，在對外植體進行滅菌的同時對其生活力也具有一定的傷害作用，滅菌時間越長對其傷害的程度越大，在取得相同滅菌效果的情況下，我們認為滅菌時間越短越有利于外植體生活力的保持。當滅菌時間低于10 min時，污染率較高，滅菌6 min時外植體全部污染。因此，用0.1% HgCl2溶液滅菌10 min的效果最佳。

2.2 種子萌發培養

將種子接種到含不同質量濃度6-BA與GA3組合的種子萌發培養基上培養，從表2可以看出，滅菌后的種子接種在不同處理的培養基上均能萌發，但是萌發情況差異較大，在添加GA3的培養基上萌發情況較好，說明GA3能有效地打破海南冬青種子的休眠，促進種子萌發。隨著GA3濃度的增加，種子萌發率反而出現下降現象，當6-BA 0.5 mg/L+GA3 05 mg/L時，種子初始萌發時間最短，且萌發率最高，達85%，極顯著高于其他處理，達到較好的種子萌發效果。種子在6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L組合的培養基上培養 15 d 后開始萌發，20 d后胚芽出現，并且開始迅速生長（圖1-A），至35 d時，種子苗高已1～2 cm（具2張以上真葉），此時，切取含2張真葉的不定芽進行叢生芽誘導培養。因此，適合海南冬青種子萌發的培養基為MS+6-BA 0.5 mg/L+GA30.5 mg/L。

2.3 初代誘導培養

將種子萌發后切取的不定芽轉接到以MS為基本培養基，不同質量濃度6-BA與NAA配比的初代誘導培養基上進行叢生芽誘導培養，培養過程中不定芽繼續生長，無愈傷組織產生。培養10 d后，不定芽的腋芽開始不斷分化而形成大量叢生芽（圖1-B），培養30 d后，大量叢生芽使得不定芽呈簇狀結構，此時可進行繼代轉接（圖1-C）。

從表3可以看出，在初代誘導培養過程中，不同激素組合對海南冬青叢生芽的誘導效果差別很大。在6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合下，不定芽數量最多，達到28.56個。正交試驗設計的極差R大小決定各生長調節劑對不定芽誘導影響程度依次為A>B>C，即6-BA>KT>NAA，最優組合為A3B2C1。由方差分析可知，6-BA對叢生芽的誘導作用達到顯著水平，KT、NAA對叢生芽的誘導作用均不顯著（表4）。因此，6-BA為主要因素，KT、NAA為次要因素。在6-BA濃度保持在0～3.0 mg/L之間時，不定芽數量與濃度成正比，適當高濃度的6-BA對叢生芽的產生起到積極作用。從不定芽生長狀況來看，各處理均無玻璃化現象發生，6-BA 3.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L處理組合不定芽長勢明顯比其他處理強，因此，綜合考慮正交試驗結果與不定芽生長狀況，采用6-BA 3.0 mg/L、KT 1.0 mg/L、NAA 0.1 mg/L組合，以此組合進行海南冬青叢生芽誘導可獲得不定芽更多的數量與更優的品質。

2.4 繼代增殖培養

將初代培養獲得的叢生芽切下單個不定芽轉接到繼代培養基中進行增殖培養，在充分考慮初代誘導培養基中各激素影響的情況下，以MS為基本培養基，添加不同質量濃度6-BA、KT與0.1 mg/L NAA組合，對繼代增殖培養基進行優化。

從表5可以看出，不同質量濃度的6-BA與KT組合獲得的芽增殖系數差異較大，6-BA是增加芽增殖系數的主導因素，當6-BA濃度為2.5 mg/L時，與不同濃度的KT組合均獲得較高的芽增殖系數，其中以6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L組合獲得最好的效果，培養20 d后實現芽增殖系數7.30倍，極顯著高于其他處理，且不定芽生長健壯，展葉良好，長勢快，有利于下一步生根誘導（圖2-A）。當6-BA濃度增加到3.0 mg/L時，芽增殖系數反而出現下降的現象，且不定芽的質量也有所下降，叢生芽容易出現簇狀而抑制了芽的伸長生長，不利于下一步生根培養（圖2-B）。當6-BA濃度相同時，KT濃度的增加對芽增殖系數的影響差異不大。因此，MS+6-BA 2.5 mg/L+KT 0.75 mg/L+NAA 0.1 mg/L 培養基是最適宜海南冬青叢生芽增殖的培養基。

2.5 生根培養

切取長約2 cm的不定芽為生根材料，在1/2MS基本培養基上添加不同濃度NAA或IBA進行生根培養，20 d后統計生根率及平均生根數（表6）。不定芽轉接7 d后根原基開始形成， 20 d后苗生長良好，根長且粗壯，莖基部無愈傷組織產生。不同濃度生長調節劑組合對不定芽生根率的影響較明顯，IBA濃度相同時，NAA濃度增加對生根率與平均生根數的增加均有促進作用，根較細長。2種生長素同時添加出現了促進生根的疊加效應，生根率、平均根數均比單獨使用IBA時高，當IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L組合時，生根率為91.33%，平均生根數為5.90條，二者均達到最大值，極顯著高于其他處理，且根粗壯、發達，有利于下一步移栽成活（圖3-A、圖3-B）。因此，1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L 較適合海南冬青誘導生根。

2.6 試管苗的移栽

待組培苗生根培養30 d后進行煉苗移栽。從表7可以看出，試管苗在不同基質上的成活率由高到低依次為菜園土-河沙（3 ∶1）>菜園土>泥炭土>泥炭土-河沙（3 ∶1）>河沙，其中，試管苗在菜園土-河沙（3 ∶1）的基質中移栽30 d后成活率達到90%（圖3-C），極顯著高于其他處理。移栽180 d后，植株高超過15 cm，生長良好（圖3-D），可進行大田移栽。因此，試管苗移栽最適宜的基質為菜園土-河沙（3 ∶1）。

3 討論

多數冬青屬植物的種子具有休眠特性而影響其快速繁育，其休眠期長短因種而異，如大葉冬青（Ilex latifolia）種子的休眠期長達3年[10]。本課題組在前期研究中發現海南冬青種子具有短暫的休眠期，秋季采集的種子需在4 ℃低溫貯藏3個月方可有效解除休眠[3]。本試驗中，為了解除海南冬青新鮮種子的休眠，我們在種子萌發培養基中添加GA3，結果表明，GA3能有效地打破海南冬青種子的休眠，促進種子萌發，當6-BA 0.5 mg/L+GA3 0.5 mg/L時，種子初始萌發時間最短，且萌發率最高，達85%，達到較好的種子萌發效果，與前人采用GA3在解除大果冬青與狹葉冬青等同屬植物的種子休眠上取得較好的積極作用的研究結果[11-12]一致。

在植物組織培養中，外植體初代誘導的結果除了與外植體本身取材有關，也與培養過程中使用的生長調節劑密切相關[13]。目前尚未發現海南冬青組織培養方面的研究報道，同屬植物組織培養方面，研究報道也較少。王慧瑜等以大葉冬青當年生嫩枝為外植體，以BA與NAA或者IBA組合實現了叢生芽的誘導與增殖培養[14]。楊燦等以紅果冬青的莖段進行組培試驗，誘導出叢生芽，并在低濃度的BA與KT配合下實現芽的繼代增殖[15]。同屬植物多數是以莖段為外植體直接誘導不定芽，我們前期研究發現，海南冬青植株內含多酚類物質較多，選用其嫩芽或者帶芽莖段作為外植體十分容易褐化而不利于不定芽誘導，種子是較理想的外植體材料，具有容易消毒、生長力旺盛的特點。本試驗采用種子萌發形成的無菌苗切去根部后作為材料進行不定芽的誘導與增殖。植物生長調節劑種類和質量濃度對海南冬青的不定芽誘導與增殖有較大影響。使用6-BA、KT與NAA組合進行初代誘導與繼代增殖篩選，6-BA對叢生芽的誘導作用達到顯著水平，是海南冬青叢生芽形成與增殖的關鍵因素，其中以6-BA 3.0 mg/L 的誘導作用最強，在一定范圍內不定芽的誘導數量與增殖系數隨著6-BA濃度的增加而增加。KT作為促進側芽發生發育的外源性細胞分裂素，組織培養中主要用于促進細胞分裂和分化，與五指毛桃[16]類似，在培養基中配合使用低濃度的KT對海南冬青不定芽的誘導與增殖均具有較大的促進效應。高濃度的細胞分裂素與低濃度的NAA配合使用，有利于不定芽的分化，NAA 0.1 mg/L與高濃度的6-BA、KT組合時達到較好的效果，與楊燦等在紅果冬青的研究結果相符。在本試驗中，以種子萌發產生的無菌苗進行叢生芽誘導，成功誘導出較多的不定芽（不定芽數量28.56個），幼小的不定芽繼代培養20 d后又獲得7.30的增殖系數，而且在培養過程中無愈傷組織產生，實現了以芽繁芽的技術特點，在有效減少變異的同時大大提高了繁殖的速度。

海南冬青不定芽在附加不同質量濃度IBA或NAA的 1/2MS培養基上均可生根，且2種生長素同時添加出現了促進生根的疊加效應，其中較適宜的生根培養基為1/2MS+IBA 0.75 mg/L+NAA 0.5 mg/L，培養20 d后可以獲得再生植株，生根率達91.33%。在不添加生長素類植物生長調節劑的空白對照中，未發現生根，說明生長素類對海南冬青生根起到了促進作用?；|的選擇對于試管苗的移栽成功與否也十分重要，適宜基質可以確保較高的試管苗移栽成活率。菜園土肥力較高，團粒結構好，但是干時表層易板結，濕時通氣透水性差；河沙通氣透水性好，但是肥力與保水性較差。本試驗把這2種基質按3 ∶1的比例混合，可有效彌補這2種基質的不足，在海南冬青試管苗移栽上取得了較好的效果，移栽成活率達到90%。

利用組織培養技術能生產優質種苗，但組培苗能否在生產上迅速應用推廣，與其移栽的便捷性、成活率、培養成本等密切相關[17]。本研究通過對海南冬青組培快繁過程中各技術環節的影響因子進行試驗與優化，篩選出海南冬青種子萌發、不定芽誘導、增殖、生根培養的最佳培養基，建立了海南冬青組培快繁的技術體系，研究結果具有擴繁系數大、栽培管理便捷、成活率高、成本低等優點，能短時間內生產出大量海南冬青優質種苗，具有較好的應用前景。

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