小麥白粉病生防菌擬諾卡氏菌屬TMG—8菌株的篩選研究

曹遠銀+王婉琳+申璐嵐

摘要：為更好地利用生防菌防控小麥白粉病危害，從不同省份、不同生態環境中采集52份土樣，用稀釋分離法得到150株菌株，通過小麥白粉孢子萌發抑制試驗、小麥離體葉片藥效試驗及溫室苗期藥效試驗篩選得到1株對小麥白粉病抑制作用較強的生防菌株TMG-8。采用16S rDNA序列分析法結合部分生化測定試驗對生防菌TMG-8進行初步鑒定，并采用抗生素抗性標記法測定生防菌TMG-8的定殖能力。初步鑒定菌株TMG-8為擬諾卡氏菌屬；生防菌可在葉面上短暫定殖，在小麥葉片上的定殖量為下部>中部>上部，在小麥苗上的定殖量為根部>莖部>葉部；菌株 TMG-8可在土壤中短期穩定定殖，其含量隨著時間逐步增加并趨于穩定，但增加幅度不大；無論是浸根處理還是灌根處理，生防菌都能在小麥苗上定殖，定殖量為根部>莖部>葉部，灌根處理比浸根處理含菌量多。

關鍵詞：小麥白粉??；生物防治；擬諾卡氏菌屬；定殖能力

中圖分類號：S435.121.4+6 文獻標志碼：A 文章編號：1002-1302（2017）01-0095-04

小麥白粉病是由禾本布氏白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici）引起的一種世界性病害，在世界各產麥區均有發生，是影響小麥生長發育的主要病害之一[1]。近年來，隨著部分地區年降水量增多[2]、冬季溫度升高[3]、耕作制度變化以及受菌種變異、品種繁雜等因素的影響[4]，我國小麥白粉病的發生與危害日趨嚴重，幾乎蔓延至全國所有麥區，在很多地區已從次要病害上升為主要病害，成為小麥生產中發病面積大、危害損失嚴重的常發性病害。

化學防治是小麥白粉病防治的重要措施，具有防治效果好、收效快、使用方便、受季節性限制較小、適于大面積使用等優點，但近年來隨著藥劑防治的一些弊端如農藥殘留、病菌產生抗藥性的出現，人們急需尋找一種安全、高效、無污染的生物農藥來解決這些問題[5]。目前，利用有益微生物防治農業植物病害具有良好的應用前景。國內外一些學者在生防菌的研究和開發方面做了大量工作并取得了良好的成果。據田小衛等報道，鏈霉菌屬次生代謝產物在質量濃度為6 000 mg/L時，對小麥白粉病的保護和治療效果分別為76.13% 和70.78%[6]。于基成等研究測定了植物源殺菌劑對小麥白粉病的保護和治療作用，防效分別為66.78%和73.33%，均優于其他生物藥劑[7]。張晶等篩選出的放線菌DL26和PJ2對小麥白粉病抑制能力較強，病情指數與三唑酮處理差異不顯著，防治效果分別達74.43%和70.01%[8]。Hajlaoui等報道Sporothrix flocculosa對小麥白粉病有一定的防治作用[9]，Timothy 等測定了S. flocculosa對小麥白粉病的防治效果，檢測結果表明其與嗎菌靈和硫磺對白粉菌有一樣的防效[10]。美國Agraquest公司曾利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QST703株系生產出生物農藥產品[10]。本研究報道了從山西、山東、河南、甘肅、南京、黑龍江、遼寧等省份和市區不同生態環境的52份土樣中分離篩選得到的生防菌株TMG-8，明確該菌株對小麥白粉病有良好的防效，并觀察其培養特征，測定部分生化特性，結合16S rDNA序列分析進行初步鑒定，同時研究了它在小麥上的定殖能力，為研制防治小麥白粉病的生防制劑打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤：分別于2010—2012年，從山西、山東、河南、甘肅、南京、黑龍江、遼寧等省份和市區不同生態環境里采集土樣52份。

供試病原菌：小麥白粉病菌由沈陽農業大學小麥病害實驗室提供。

供試培養基：分離培養基采用馬鈴薯瓊脂糖固體（PDA）培養基、馬鈴薯瓊脂糖液體（PDB）培養基、牛肉膏蛋白胨固體（NA）培養基、牛肉膏蛋白胨液體（NB）培養基、高氏1號固體培養基、高氏1號液體培養基、1.5%瓊脂液體培養基。

1.2 土壤生防菌分離與篩選

1.2.1 生防菌分離 采用土壤稀釋分離法，制備不同濃度梯度的土壤菌懸液（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7），依次分別接入PDA、NA和高氏1號培養基中，置于28 ℃下恒溫培養3～5 d，挑取形態、顏色等培養性狀不同的單菌落轉接，再經劃線培養、純化后轉接到相應的液體培養基中，28 ℃下130 r/min培養4～5 d，離心收集上清液。

1.2.2 孢子萌發抑制試驗 將菌株發酵液分別與1.5%融化狀態的瓊脂培養基以1 ∶1混合，取500 μL滴加到載玻片上，將待測定的小麥白粉菌孢子均勻抖落到培養基上，于 18 ℃ 無光條件下培養48 h，以含1.5%瓊脂的無菌水（1 ∶1）培養基上的孢子萌發率作對照，以1 g/L 15%的三唑酮可濕性粉劑為對照藥劑。每處理重復3次，鏡檢并計算孢子萌發抑制率。

1.2.3 小麥離體葉藥效試驗[11-12] 選取萌發抑制率較高的菌株進行離體藥效試驗。采用三點法接種白粉菌于離體苗期小麥葉片上，待肉眼可見白粉菌侵染時，將10 mL發酵液均勻噴霧在葉片上，同時以1 g/L 15%的三唑酮可濕性粉劑為對照藥劑。將處理的小麥葉片放在室溫（18～20 ℃）光照培養，待清水對照充分發病時進行調查（約10 d）。

1.2.4 溫室盆栽苗期藥效試驗[11-12] 將離體葉片試驗藥效好的菌株再次進行盆栽苗期藥效試驗。待小麥長到2葉1心時接種小麥白粉病菌（在各處理區域均勻擺放3盆已經充分發病的盆栽小苗），用1 g/L 15%的三唑酮可濕性粉劑為對照藥劑，待病菌侵染發病后噴灑藥劑，藥劑均采用菌株發酵液原液（菌量控制在106 CFU/mL），噴藥劑量為15 mL/盆，在施藥后1 d按照小麥白粉病病害分級標準調查病情指數，然后每隔5 d 調查1次，連續調查4次，并計算防效。

1.3 生防菌株16S rDNA序列分析

生防菌DNA的提取采用生工生物工程（上海）股份有限公司Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（型號：SK8255）方法進行。采用細菌鑒定通用引物1（27F和1 492R）和細菌鑒定通用引物2（7F和1 540R）進行PCR擴增。PCR反應體系為25 μL，10×Buffer（加Mg2+）2.5 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，dNTP Mixture 0.5 μL，Taq DNA polymerase 0.5 μL，基因組DNA（20～50 ng/μL）0.5 μL，ddH2O 20 μL。PCR擴增反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環。PCR產物的純化與回收參照生工生物工程（上海）股份有限公司SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（型號：SK8131）說明書，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司測序。測得基因在GenBank中進行Blast同源序列檢索，并用MEGA 4.0軟件對所得序列構建系統發育進化樹。

1.4 生防菌部分生化特性測定[13]

測定菌株明膠液化、纖維素分解、牛奶分解、淀粉水解及硫化氫產生的生化特性。培養基配制參照《常見細菌鑒定手冊》[14]。培養基置于28 ℃下培養3～15 d。

1.5 生防菌定殖能力測定[15-17]

1.5.1 菌株抗生素標記 將培養48 h的生防菌菌株用無菌水制成懸浮液，接入含有一定量的抗生素（濃度為20 μg/mL）的抗性平板上，以不加抗生素的平板為對照，篩選出菌株不能生長的平板，利用該培養基中含有的抗生素對生防菌株進行標記。將菌株接種于抗生素濃度為20 μg/mL的高氏1號培養基中，逐步增加抗生素濃度篩選出能在含500 μg/mL抗生素的高氏1號培養基上穩定生長且形態特征與原菌株一致的突變菌株。

1.5.2 生防菌在葉片上定殖能力試驗 將標記后的生防菌發酵液均勻噴灑在小麥葉片上，立刻取上、中、下部葉片，分離并記錄初始菌量，觀察其能否在葉片上定殖。以后每隔5 d分離1次，計算每克葉上的含菌量，記錄菌量變化。

1.5.3 生防菌在土壤中定殖能力試驗 將標記后的生防菌發酵液作為菌懸液備用。4.5 kg土壤滅菌裝入花盆中，將 10 mL 發酵液均勻噴灑于土壤中，并噴灑適量的無菌水，使土壤保持濕潤，拂去表土，采用三點取樣法取土，測每克土含菌量，記錄初始菌量。以后每隔7 d分離1次，計算每克土的含菌量和菌量變化。

1.5.4 菌液浸根后的定殖情況 小麥種子經表面消毒后在培養箱中催芽，等種子發芽后用標記生防菌發酵液浸根1 d，播種于無菌土壤中。15 d后開始分離小麥（根、莖、葉）上的生防菌，以后每隔10 d分離1次，計算每克根、莖、葉中的含菌量，記錄標記菌數量的變化情況。

1.5.5 菌液灌根后的定殖情況 小麥種子表面消毒播種于花盆中，待長到1心1葉時，向花盆中注入20 mL標記菌發酵液，15 d后開始分離根、莖、葉上的生防菌，以后每隔10 d計算每克根、莖、葉中的含菌量，記錄標記菌數量的變化。

2 結果與分析

2.1 土壤生防菌的分離與篩選

采用稀釋分離法分離得到菌株150株，其中真菌65株，細菌49株，放線菌36株；再加上2010—2011年實驗室分離得到的放線菌菌株100株，共250株用于小麥白粉病潛在生防菌的篩選。通過孢子萌發試驗共得到6株（放線菌5株，真菌1株）對小麥白粉菌孢子萌發有抑制作用的生防菌株，其中生防菌株TMG-8對小麥白粉菌孢子萌發抑制作用較強，抑制率為90.0%。對照組三唑酮可濕性粉劑對孢子萌發抑制率為97.8%。

對生防菌進行離體葉藥效篩選試驗。結果表明，菌株TMG-8的防效是73.8%，1 g/L 15%三唑酮的防效為85.9%，所以該菌株對小麥白粉病具有良好的防效。

溫室盆栽試驗結果（表1）表明，菌株TMG-8的防效在噴藥后1～15 d內穩定在63.58%～73.98%之間，三唑酮則穩定在85.30%～95.33%之間。在經過TMG-8處理后的白粉病病情指數在1～10 d內上升幅度很小，能夠維持在較低較穩定的狀態（圖1）。在15 d時，生防菌防效有所降低，這說明菌株在短時間內對小麥白粉病菌有良好的抑制效果，并且有短暫的持效期。

2.2 生防菌株16S rDNA序列分析結果

對菌株TMG-8進行PCR擴增，結果得到約1.5 kb的PCR產物（圖2）。菌株TMG-8的16S rDNA序列長度為 1 402 bp，將菌株序列在GenBank中進行Blast比對（表2），結果表明，菌株TMG-8與NCBI登錄號為JF895817.1的擬諾卡氏菌屬鏈孢擬諾卡氏菌（Streptomyces sp. GxW1）同源性最高，高達100%（圖3）。

2.3 生防菌株培養特征及生化特性測定結果

菌株TMG-8在高氏1號培養基上生長良好，菌落呈粉色，培養期菌落表面光滑且有明顯的輪紋，菌落呈圓形，隨著培養時間的延長，培養基近菌落周圍開始出現明顯的透明現象。

菌株TMG-8生化特性見表3。結果表明，菌株能夠使明膠液化，可以使牛奶石蕊培養基先凝固后胨化，能夠分解纖維素，可以產生H2S，并能夠水解淀粉。

2.4 生防菌定殖能力測定結果

經天然抗藥性檢測，生防菌TMG-8對硫酸鏈霉素不具有抗性，因此選用硫酸鏈霉素對其進行標記。

由表4可知，一般在小麥上部葉片的含菌量小于中部，中部小于下部。生防菌可以在葉面上短暫存在，在15 d時，中部和下部葉片含菌量只有102數量級。從表4中可以看出，在5～10 d 之間，生防菌可以保持103～104的數量級。

由表5可見，菌株TMG-8都可以在土壤中短期穩定定殖，在土壤中的含量隨著時間逐步增加并趨于穩定，但增加的幅度并不大，前后相差1個數量級，為108～109數量級，所以菌株TMG-8可以在土壤中短期定殖。

通過生防菌TMG-8在小麥上的定殖試驗（表6）可以得出，無論是浸根處理還是灌根處理，菌株TMG-8都能在小麥苗上定殖，定殖量為根部>莖部>葉部。TMG-8經灌根處理后，根部、莖部和葉部含菌量均為先增加后減少并逐步趨于穩定；灌根處理55 d后，2株放線菌在根、莖、葉中的含量都還在102數量級上，且菌株TMG-8含量變化比較穩定，上下波動不大。使用灌根和浸根處理均能使菌株TMG-8定殖，但是灌根處理放線菌的含量比浸根處理多。

3 結論與討論

本研究從各省份不同生態環境中采集多份土樣，經小麥白粉菌孢子萌發抑制試驗、小麥離體葉片藥效試驗、溫室盆栽苗期試驗等層層篩選，得到了1株生防菌TMG-8，該菌在短時間內對小麥白粉病有良好的抑制效果，并且有短暫持效期。孢子萌發抑制試驗中，菌株TMG-8對小麥白粉菌孢子萌發的抑制率為90.0%；離體葉片試驗中，菌株TMG-8的防效是73.8%；溫室盆栽苗期試驗中，菌株TMG-8的防效在噴藥后的1～10 d內穩定在63.58%～73.98%之間，具有一定的生防潛力以及應用價值。根據16S rDNA序列分析比對結果，初步鑒定菌株TMG-8屬于擬諾卡氏菌屬。通過對其部分生化特性測定可知，菌株TMG-8能夠向胞外分泌蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶，還能分解含硫氨基酸產生H2S。

本試驗選用的抗生素抗性標記法具有快速、簡便且成本低的優點，此方法不會導致原始菌株的遺傳穩定性以及其他重要特性的變異與喪失[18]。通過試驗可知，生防菌可在葉面和小麥苗上短暫存在，在小麥葉片上的定殖量為下部>中部>上部，在小麥苗上的定殖量為根部>莖部>葉部。在 5～10 d之間，可以保持103～104數量級，這與其生防效果在5～10 d相對穩定一致。菌株TMG-8可在土壤中短期穩定定殖，在土壤中的含量逐步增加并趨于穩定，但增加的幅度并不大，前后相差1個數量級，為108～109數量級。無論是浸根處理還是灌根處理，菌株TMG-8都能在小麥苗上定殖，定殖量為根部>莖部>葉部。使用灌根和浸根處理均能使放線菌定殖，但是灌根處理菌的含量比浸根處理多。這與先前報道有相似之處，如姚佳等研究HD8、CS4、YJ1、BC32在油菜根際土壤中短期定殖，HD8在土壤中含量是先升高后降低，數量最多達到108數量級；YJ1施入土壤后，其含量一直上升，且研究4株放線菌在油菜苗上定殖時，灌根處理比浸根處理分離得到的放線菌數量要多[19]。

植物病害的生物防治受植株、病原菌、生防菌以及環境等多方面因素的影響。由于放線菌在葉片和苗上的定殖容易受環境和雨水沖洗等多方面的影響，所以放線菌只能在葉片上短暫存在。本研究在室內環境下測定菌株TMG-8對小麥白粉病有一定的防效，但要想開發成為生防制劑還需研究其田間環境下的防治效果以及菌株TMG-8對土壤根際酶的影響。

參考文獻：

[1]何家泌，宋玉立，張忠山，等. 小麥白粉病及其防治 Ⅰ. 小麥白粉病的分布、癥狀和危害[J]. 河南農業科學，1998，37（1）：17-18.

[2]姚惠明，吳永祥，關鐵生. 中國降水演變趨勢診斷極其新事實[J]. 水科學進展，2013，24（1）：1-10.

[3]梁蘇潔，丁一匯，趙 楠，等. 近50年中國大陸冬季氣溫和區域環流的年代際變化研究[J]. 大氣科學，2014，38（5）：974-992.

[4]Hua W，Liu Z J，Zhu J，et al. Identification and genetic mapping of pm42，a new recessive wheat powdery mildew resistance gene derived from wild emmer （Triticum turgidum var. dicoccoides）[J]. Theoretical and Applied Genetics，2009，119（2）：223-230.

[5]劉君麗，司乃國，解匯敏，等. 小麥白粉病化學防治現狀及發展方向[J]. 農藥，2002，41（4）：15-16.

[6]田小衛，張陳云，吳文云. 一株放線菌次生代謝產物抗菌活性的初步研究[J]. 植物保護，2004，230（2）：51-54.

[7]于基成，劉秋朱，桂 清，等. 不同生物源藥劑對小麥白粉病的防治效果及機理探討[J]. 沈陽農業大學學報，2007，38（4）：512-517.

[8]張 晶，曹遠銀，程艷輝，等. 小麥白粉病生防菌株的篩選及其防效的初步研究[J]. 河南農業科學，2011，40（6）：97-99.

[9]Hajlaoui M，Belanger R. Antagonism of the yeast-like phylloplane fungus Sporothrix flocculosa against Erysiphe graminis var. tritici[J]. Biocontrol Science & Technology，1993，3（4）：427-434.

[10]Timothy C，Paulitz R，Belanger R. Biological control in greenhouse systems[J]. Annual Reviews of Phytopathology，2001，39（4）：103-133，28-32.

[11]王衛紅. 不同殺菌劑對小麥白粉病的防效試驗[J]. 現代農業科技，2010（1）：165-168.

[12]劉積芝. 小麥白粉病的防治指標和藥劑防治[J]. 山東農業大學學報（自然科學版），1988，19（2）：87-89.

[13]桑利偉，劉愛勤，孫世偉，等. 一株拮抗胡椒瘟病菌的生防菌S的鑒定及其生物學特性研究[J]. 中國生物防治學報，2015，31（2）：291-296.

[14]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001.

[15]梁軍鋒，薛泉宏，牛小磊，等. 7株放線菌在辣椒根部定殖及對辣椒葉片PAL與PPO活性的影響[J]. 西北植物學報，2005，25（10）：2118-2123.

[16]翁啟勇，陳慶河，趙 健，等. 利福平標記菌株BS1在番茄、茄子根部及土壤中的定殖動態[J]. 福建農業學報，2003，18（2）：87-88.

[17]袁樹忠，周明國. 辣椒疫病生物防治菌株的篩選與定殖[J]. 揚州大學學報（農業與生命科學版），2006，27（4）：93-97.

[18]姚震聲，陳中義，陳志誼，等. 綠色熒光蛋白基因標記野生型生防枯草芽孢桿菌的研究[J]. 生物工程學報，2003，19（5）：551-556.

[19]姚 佳. 放線菌發酵液對油菜菌核病的生物防治研究[D]. 雅安：四川農業大學，2010.魯海菊，李 河，史淑義，等. 云南省石榴干腐病病菌生物學特性及其防治藥劑篩選[J]. 江蘇農業科學，2017，45（1）：99-102.