黔西北優質蜜環菌菌株的初步篩選

王彩云+王永+嚴顯進

摘要：比較5株黔西北本地蜜環菌與引進的A9菌株的生長速度、生物量、菌索形態、熒光強度等生物學特性。結果發現，各菌株間存在明顯差異，菌索平均生長速度依次為MHJ-3>MHJ-1=A9>MHJ-6>MHJ-7>MHJ-8，菌索平均生物量依次為MHJ-3>A9>MHJ-1>MHJ-6>MHJ-8>MHJ-7，MHJ-3在菌絲萌發速度、分枝狀況、熒光強度及暗培養20 d后菌索生物量等生長特性方面均優于A9。5株本地天麻共生蜜環菌中，菌株MHJ-3活性最強、性狀最優，MHJ-1菌株次之。

關鍵詞：天麻；蜜環菌；黔西北；優質菌株；生長特性

中圖分類號： Q949.329+.81 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0117-03

蜜環菌（Armillaria mellea）別稱榛蘑、榛子蘑，屬擔子菌亞門（Basiaiomycotina）傘菌目（Agaricales）白蘑科（Trichfomataceae）蜜環菌屬[1]。自1790年Vahl首次鑒定蜜環菌后，發現蜜環菌在全世界廣泛存在，且能侵染600多種樹木[2-4]，并導致林木根腐病，造成巨大的經濟損失。但其致病性并非絕對的，有些植物被侵染后生長旺盛，如天麻（Gastrodia elata）、豬苓（Polyporus umbellatus），因此蜜環菌由于其致病性及特殊性成為國內外學者的研究熱點[5-6]。此外，蜜環菌又是一類藥食兼用菌，具有重要價值，其產品制劑是治療眩暈、頭痛、神經衰弱的有效藥物，目前已廣泛應用于臨床治療[7]；其深層發酵產物中富含多糖、必需氨基酸、倍半萜類及嘌呤類化合物等多種有效成分[8]，具有較強的增智健腦、鎮痙熄風、神經調節、延緩衰老以及抗癌等藥理作用[9-11]，并可增強機體免疫力，與天麻藥理作用及臨床療效類似[12]。

目前由于野生天麻資源的大量采挖導致市場供求關系緊張，天麻仿野生種植成為開發市場、提高產量的重要手段。用于栽培天麻的蜜環菌經連續無性繁殖，菌種會發生嚴重退化，從而導致天麻的產量和天麻素含量的急劇下降[13]，黔西北地區栽培天麻所用的蜜環菌大多為引進種，且已出現菌索細、生長緩慢、易感雜、抗旱能力差等缺陷，仿野生栽培中出現菌索過細、“空窩”、菌索過早干枯等狀況[14]，這些問題嚴重影響了天麻的產量及質量。此外，趙俊和趙杰研究表明，全國各個地區天麻種類不同且存在地域差異，跨區域引進菌種或推廣存在不科學性[15]。因此，選育適宜當地種植的優良蜜環菌菌株成為天麻仿野生栽培綜合配套技術研究的瓶頸，也是提高天麻產量與質量的迫切問題。本研究針對黔西北地區長期引種造成的蜜環菌菌種退化及天麻產量、質量下降等問題，比較5株本地野生蜜環菌及引進種A9的菌索生長速度、平均生物量、熒光反應強度等生物學特性，以期為黔西北地區篩選出較好的天麻伴生蜜環菌菌株，為解決蜜環菌的跨地區引種問題提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

蜜環菌MHJ-1、MHJ-3、MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8從黔西北地區野生天麻生長地長有蜜環菌的菌材上分離獲得（表1），蜜環菌A9購自陜西省西鄉食用菌研究所。

1.2 培養基

PDA固體培養基（200 g馬鈴薯、20 g 蔗糖、8 g瓊脂、1 000 mL 水）、PDA半固體培養基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、5 g瓊脂、1 000 mL水）、PDA液體培養基（200 g馬鈴薯、20 g葡萄糖、1 000 mL水），按常規方法制作。試管PDA斜面培養基：配制PDA培養液（200 g馬鈴薯、20 g蔗糖、8 g瓊脂、1 000 mL 水），裝入試管中達試管1/3，滅菌后，45°傾斜放置至培養基冷卻。所有培養基均在101 kPa、121 ℃下滅菌 20 min。

1.3 試驗方法

1.3.1 蜜環菌菌索分離 將長有蜜環菌的菌材削去外層樹皮，用洗潔精清洗后于自來水下自然沖洗30 min。轉移到超凈工作臺中，75%乙醇浸泡45 s后用無菌水沖洗5次，再用0.1% HgCl2溶液中浸泡約8 min，取出后用無菌水沖洗5次，取出置于無菌培養皿中，用無菌濾紙吸凈表面水后，切成 1.0 cm×0.5 cm左右大小，置于PDA試管斜面上，每支試管放置一段時間。25 ℃暗培養，定期觀察記錄。

1.3.2 生長速度測定 在PDA培養皿上接種蜜環菌菌種，每皿接種量為1根長0.7 cm的成熟菌索段，在25 ℃下靜置暗培養，每3 d測量每組菌索的生長速率，直至菌索停止生長，然后計算菌索平均生長速率；觀察記錄菌索顏色、密度、粗細、分枝數等指標，每組3次重復。

1.3.3 生物量測定 將100 mL PDA液體培養基裝入250 mL三角瓶中，用封口膜封口，121 ℃滅菌20 min，冷卻后挑取1塊0.5 cm×0.5 cm的菌塊于三角瓶中，在25 ℃下黑暗條件下振蕩培養，每隔48 h觀察菌絲體和菌索的形態特征。20 d后在網袋上用自來水沖洗菌索上附著的培養基，洗凈后的培養物在50 ℃下烘干，冷卻后稱其質量，每組3次重復。

1.3.4 其他培養性狀對比 在培養瓶中倒入30 mL PDA半固體培養基，并接種蜜環菌，每瓶接種1塊0.5 cm×0.5 cm的菌塊，接種后于25 ℃、相對濕度80%的條件下靜止暗培養，每24 h觀察1次生長情況，并記錄菌絲萌發和菌索開始生長的時間，菌索形態、生長狀況及熒光反應等生長特性。

2 結果與分析

2.1 各蜜環菌的生長速度對比

6株蜜環菌在相同生長條件下菌索平均生長速度存在差異，其中蜜環菌MHJ-3的菌索生長速度最快，平均生長速度達1.17 cm/d；其次是MHJ-1和A9，其平均生長速度均為0.95 cm/d；MHJ-6、MHJ-7次之；MHJ-8菌株平均生長速度最慢，僅為0.60 cm/d。此外，MHJ-3和MHJ-1、A9的生長速度達到顯著差異，與MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的生長速度達到極顯著差異；蜜環菌MHJ-1與A9在生長速度上無顯著差異，與MHJ-7、MHJ-8的菌索生長速度差異極顯著（表2）。

2.2 各蜜環菌的生物量對比

6株蜜環菌在25 ℃下暗培養20 d后生物量存在明顯差異，其中MHJ-3的生物量最大，平均生物量達1.580 6 g，比對照菌株A9的平均生物量（1.537 6 g）高約2.6%；其他4株菌株的生物量均低于A9，其中MHJ-7的平均生物量最小，僅為0.948 6 g。此外，蜜環菌MHJ-3與A9的生物量差異顯著，與MHJ-1、MHJ-6、MHJ-8、MHJ-7菌株的生物量差異極顯著；對照菌株A9的生物量與MHJ-1、MHJ-6、MHJ-8、MHJ-7菌株的生物量之間存在極顯著差異；MHJ-1與MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8的生物量間存在極顯著差異；菌株MHJ-8與MHJ-7的生物量差異不顯著（表3）。

2.3 各蜜環菌的培養特征比較

6株菌株在25 ℃下培養時，各菌株菌絲萌發時間、菌索開始生長時間、菌索分枝狀況及熒光反應強度等生長特性有所不同，尤其是菌索的分枝特征和熒光反應強度尤為明顯（表4）。其中，蜜環菌MHJ-3的菌菌絲萌發最快，菌索粗壯且分枝多，培養過程中無黑色素產生，生長均勻，熒光反應強烈，生長特性最好。對照菌A9菌索黃白色、粗壯、分枝多，但菌索部分卷曲，且有少量黑色素產生，其活性及生長特性弱于蜜環菌MHJ-3。蜜環菌MHJ-1生長狀態及活性與A9相當，雖然其菌索不及A9粗壯，但其菌索有網狀分枝，且各菌索生長均勻，在培養過程中無黑色素產生，整體生長性狀較優良。蜜環菌MHJ-6、MHJ-7、MHJ-8在培養過程中，菌索由白色逐漸變為紅棕色，且有黑色素產生，但各菌株的生長狀態也有差異，MHJ-6菌索較粗、分枝多，但生長不均勻，部分卷曲；MHJ-7、MHJ-8的菌索均稍細、分枝少，生長狀態及活性整體弱于對照菌A9。

3 結論與討論

蜜環菌進行多代天麻栽培后出現明顯的菌種退化與變異，如用已發生退化的菌種伴栽天麻則會導致天麻產量與品質急劇下降[16]。不科學性的跨地區引種及長期引用同樣的菌種會造成天麻減產，因此本研究加大了對黔西北地區蜜環菌的篩選力度，致力于選出適合于本地種植的優良蜜環菌。

目前，篩選優良蜜環菌主要依據菌索生長速度、生物量、分枝數量、生長勢、菌索的粗細、菌絲萌發和菌索產生的時間、熒光反應強度等標準[17]。本試驗基于以上幾點，對黔西北本地5株野生天麻共生蜜環菌和1株外來優良天麻共生蜜環菌菌株進行了研究，本地菌株MHJ-3菌索生長速度、分枝狀況、菌索生物量、熒光反應強度等特性均強于A9，為所有篩選菌株中表現最突出的菌株。菌株MHJ-1除生物量弱于A9外，生長速度等指標均與A9基本持平，其余3株蜜環菌菌株的菌索平均生長速度、平均生物量、熒光強度等實驗室生理性狀指標均弱于A9。從基本試驗性狀來看，5株本地蜜環菌中，MHJ-3菌株的活性最強、性狀最優，MHJ-1次之。

大量研究表明，蜜環菌不同菌株對天麻產量會產生不同的影響[18]，且不同的蜜環菌-天麻組合對天麻素含量有顯著影響[15]，在實際生產中，培養蜜環菌主要是為了伴栽天麻，因而蜜環菌的品質直接影響到天麻的產量和品質。由于不同的地理區域分布著不同種類的蜜環菌[15]，且蜜環菌種類繁多，因此并非所有的蜜環菌都與黔西北地區天麻具有良好的共生關系。而本地蜜環菌MHJ-3、MHJ-1菌株與黔西北地區天麻是否具有良好的共生關系、能否有效提高天麻產量及質量，還有待于進一步的野外觀察證明。

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