大球蓋菇的分離純化及ITS序列鑒定

張健+張國權+鄒莉

摘要：以吉林長白山地區的野生大球蓋菇為材料，對其進行1～5 h不同時間的晾曬處理，采用組織分離法分別對其菌蓋、菌蓋與菌柄交接處、菌柄上端和菌柄基部的組織進行分離純化，通過測定菌絲生長速度、生長勢和污染率等，篩選出分離純化的最適晾曬時間和最佳部位；設置5種液體培養基配方培養液體菌種，通過測定菌絲體生物量、菌絲球密度和形態，篩選出最佳的液體培養基配方；最后將分離物進行ITS序列分析，計算遺傳距離，并采用鄰接法構建NJ系統發育樹。結果表明，分離純化最適晾曬時間為2 h，最佳分離部位為菌蓋與菌柄交接處，此種情況下菌絲生長速度最快，菌絲長勢最好，污染率最低；最佳的液體培養基配方為A2，菌絲體生物量最高，菌絲球密度最大，形態最好；最后分離菌株經ITS序列測定，系統發育分析證實其為大球蓋菇。

關鍵詞：大球蓋菇；組織分離；ITS序列分析；系統發育分析

中圖分類號： S646.904 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0120-03

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）別稱酒紅球蓋菇、皺環球蓋菇，屬擔子菌門（Basidomycota）層菌綱（Hymenomycetes）傘菌目（Agaricales）球蓋菇科（Strophariaceae）球蓋菇屬（Stropharia），是國際菇類交易市場上十大菇類之一，也是聯合國糧農組織（FAO）向發展中國家推薦栽培的特色食用菌之一[1]。大球蓋菇鮮菇色澤艷麗，肉質脆嫩滑爽，干品氣味清香，營養豐富，具有很高的食用價值和藥用價值，頗受國內外消費者歡迎，具有非常廣闊的發展前景。大球蓋菇的栽培管理較為粗放，對其冬閑田露地栽培[2]、大棚反季節栽培[3]、畦式栽培、層架式栽培、地坑式栽培等[4]多種栽培模式進行深入研究，對利用稻草、玉米秸稈、菌渣等不同栽培料栽培大球蓋菇也進行多樣化比較[5-8]，取得了豐富的研究成果，但關于大球蓋菇母種的獲得、液體培養基配方的篩選以及如何對菌種進行準確鑒定還未見報道。ITS（internal transcribed spacer）是核糖體內轉錄間隔區，包括ITS1和ITS2兩部分，連同二者中間的5.8S rDNA基因組成ITS1-5.8S-ITS2結構，被廣泛應用于真菌菌種鑒定、系統發育、條形碼和群體多樣性研究[9]。本研究對采自吉林長白山地區的野生大球蓋菇進行組織分離，獲取母種，篩選最適合液體菌種生長的培養基配方，并對子實體和分離菌株的ITS序列進行測序比對，構建系統發育樹，旨在從分子水平上對大球蓋菇進行鑒定，進而為大球蓋菇的開發和利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大球蓋菇子實體于2015年9月采自吉林省長白山地區。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養基的制備 研究使用的分離培養基為PDA培養基，培養基制作方法如下：將馬鈴薯洗凈去皮，用電子天平稱取200 g切成1 cm3的小塊，用紗布包好后放入1 000 mL水中煮沸；待馬鈴薯塊軟化后撈出，加入葡萄糖20 g，瓊脂15 g，再次煮沸，加水補足 1 000 mL；再用雙層紗布過濾，倒入錐形瓶內；將瓶口用封口膜封好后，用高壓滅菌鍋121 ℃滅菌 20 min；滅菌結束后，待培養基溫度降至不燙手但未凝固時，在超凈工作臺內，定量倒入直徑為8 cm的培養皿中，裝液量為20 mL，凝固后備用。

1.2.2 子實體晾曬時間對分離的影響 以剛采集到的部分野生大球蓋菇新鮮子實體作為對照，將大球蓋菇放置在充足陽光下晾曬，晾曬時間為10：00—15：00，分別取晾曬1、2、3、4、5 h的子實體和新鮮子實體進行組織分離。將菌蓋從中間撕開，挑取0.3 cm大小的菌肉組織接于PDA平板培養基中心部位，每個平板接1塊菌肉，蓋蓋后用封口膜封好，每組設置10個重復，放置在25 ℃恒溫培養箱中進行培養，每天觀察菌肉組織的萌發、污染以及菌絲生長情況。

1.2.3 子實體不同部位對分離的影響 將分離要使用的解剖刀、鑷子、封口膜以及PDA平板放入超凈工作臺中進行紫外滅菌。將大球蓋菇經處理后分離效果最好的子實體，用75%乙醇擦拭表面2～3遍，用無菌的解剖刀在菌蓋頂部中間劃口，用手撕開，注意避免手接觸到內部的菌肉。用解剖刀分別在子實體菌蓋、菌蓋與菌柄交接處、菌柄上端和菌柄基部劃取一小塊組織，用無菌鑷子夾起，迅速放置于制備好的PDA平板培養基中心處，每個平板接1塊組織，每組設置10個重復，封口膜封口后置于25 ℃恒溫培養箱中進行培養，每天觀察并記錄組織體的萌發情況、污染情況和菌絲生長情況。

1.2.4 液體培養基的制備 研究共采用5種液體培養基研究培養基對菌絲生長的影響，各培養基制作方法如下。

（1）基礎液體培養基A1。將馬鈴薯洗凈去皮，稱取 300 g，切成1 cm3小塊，用紗布包好后放入1 500 mL水中煮沸；待馬鈴薯塊軟化后撈出，加入30 g葡萄糖、1.5 g KH2PO4和0.75 g MgSO4，再次煮沸；加水補足1 500 mL，再用雙層紗布過濾，倒入500 mL錐形瓶內，每個錐形瓶分裝300 mL液體培養基；封口膜封口后，放入高壓滅菌鍋內，121 ℃滅菌 30 min 以備用。（2）加富液體培養基A2?；A液體培養基A1+15 g蛋白胨。（3）加富液體培養基A3?；A液體培養基A1+15 g尿素。（4）加富液體培養基A4?；A液體培養基A1+15 g酵母膏。（5）加富液體培養基A5?；A液體培養基A1+15 g硫酸銨。

1.2.5 不同液體培養基配方對菌絲生長的影響

1.2.5.1 菌塊培養及液體培養基接種培養 將由同一子實體的同一部位分離獲得的母種進行擴繁，接種于新的PDA平板培養基中心，待菌絲長滿整個平板培養基后，用直徑為 5 mm 滅過菌的打孔器在距平板中心接種點3 cm處打孔，將菌齡一致的菌塊轉接到液體培養基中，每瓶液體培養基接入菌塊10塊，每個配方設置5個重復。將接入菌塊的液體培養基錐形瓶放入恒溫振蕩器內，在25 ℃、130 r/min的條件下培養10 d，觀察菌絲球形態。

1.2.5.2 生物量的測定 取50 mL液體菌種，2 000 g離心20 min，去上清；菌絲體沉淀經蒸餾水充分洗滌后，濾紙過濾；待濾液無色透明后收集菌絲體，80 ℃真空干燥至恒質量，電子天平準確稱質量。計算公式為：

菌絲體生物量（g/L）=菌絲體干質量（g）0.05（L）×1 000。

1.2.5.3 菌絲球密度的測定 將培養至10 d的液體菌種搖勻后，用移液器吸取1 mL的菌液，加入9 mL的無菌水中，稀釋10倍，測定菌絲球個數。

1.2.6 DNA的提取 采用快捷型植物基因組 DNA 提取試劑盒（天根）分別對大球蓋菇的子實體和分離培養得到的菌絲體進行基因組 DNA提取。將大球蓋菇子實體撕開用滅過菌的鑷子夾取內部完好的菌肉，放于研缽中，加入液氮充分研磨；菌絲體采用錐形瓶中的液體菌種，經紗布過濾后，用無菌水沖洗3～5遍，將菌絲擰干，取適量放于研缽中，加入液氮充分研磨。其余步驟參照說明書。

1.2.7 ITS序列的擴增 采用通用引物ITS1和ITS4（ITS1：5′-TCCGTAGGT-GAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）用于rDNA ITS 區段的 PCR 擴增[10]。擴增體系為50 μL，其中35.5 μL去離子水，5 μL 10×PCR buffer，4 μL dNTPs（2.5 mmol/L），ITS1/ITS4 引物各2 μL，0.5μL Taq DNA 酶（5 U/μL），1 μL模板DNA（濃度 20～50 mg/L）。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個循環；72 ℃反應7 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后4 ℃保存。

1.2.8 ITS序列的測序與分析 為了保證測序的準確率，PCR產物經膠回收純化后用正反向引物雙向測序，測序由哈爾濱博仕生物技術有限公司完成。

將測序結果在NCBI中作BlastN比對，找出并下載 >90%相似性序列，用ClustalX2.1的Alignment程序對所有同源序列進行多重對位排列。用MEGA 5.02軟件進行系統發育分析和進化樹的構建。用Kimura2-parameter 模式計算遺傳距離，所有對位排列結果中的空位（gaps）或缺失數據（missing data）作完全刪除（complete deletion）處理，進化距離分析采用鄰位相連法（NJ，neighbor-joining）。系統樹每個分支的統計學顯著性分析以自展法（bootstrap）進行檢驗，重復次數為1 000次。

2 結果與分析

2.1 子實體晾曬時間對分離的影響

由表1可知，分離新鮮子實體污染率達到了30%，而經過晾曬1 h，污染率降低至10%，晾曬2～5 h，污染率降為0。晾曬時間越長，萌發越慢，新鮮子實體和晾曬1～2 h的子實體分離時，萌發最快，只需2 d；晾曬5 h時，分離的菌肉組織不萌發。晾曬時間越長，菌絲生長越慢，晾曬2 h的子實體分離后，菌絲生長速度最快，為8.0 mm/d，但與新鮮子實體和晾曬1 h的子實體差別不大。新鮮子實體和晾曬1～2 h的子實體，菌絲生長濃密，長勢旺盛；但晾曬3 h之后，菌絲變得稀疏，長勢較弱。綜上所述，采用晾曬2 h的大球蓋菇子實體進行分離，既能有效地降低污染率，又不影響萌發和菌絲的生長。

2.2 子實體不同部位對分離的影響

從表2可以看出，大球蓋菇子實體菌蓋與菌柄交接處分離后，菌絲的生長速度最快，達到8.9 mm/d；其次是菌柄上端（8.5 mm/d）和菌蓋（8.0 mm/d）；菌柄基部最慢，僅為 7.4 mm/d。除菌柄基部外，其他3個部位菌絲的長勢都很濃密旺盛；菌柄基部的污染率達到了10%，其他3個部位污染率則為0。綜合分析，菌蓋與菌柄交接處為最佳分離部位。

2.3 不同液體培養基配方對菌絲生長的影響

如表3所示，不同的液體培養基配方上生長的菌絲存在很大差異。A2的菌絲體生物量（6.8 g/L）和菌絲球密度（138個/mL）均明顯高于其他4組培養基；其次為A4培養基，菌絲體生物量為5.5 g/L，菌絲球密度為109個/mL；A3的菌絲體生物量和菌絲球密度則最小，分別為3.7 g/L、65個/mL。A2和A4配方的菌絲球如小米粒大小，呈圓球狀，大小均一，菌液稠密；其他3組配方的菌絲球都如綠豆粒大小，呈刺球狀，其中A1配方的菌絲球大小均一，菌液濃度較稠密；而A3和A5配方的菌絲球大小不均一，菌液濃度較稀疏。綜上分析，采用A2培養大球蓋菇菌絲體最佳，其次為A4培養基。

2.4 ITS區段的PCR產物及測序

對大球蓋菇子實體及分離培養得到的菌絲進行DNA提取，并以提取的DNA為模板進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到如圖1所示的特異性條帶。由圖1可以看出，S1與S2片段大小一致，約為650 bp，與測序得到的基因片段長度S1 （649 bp）和S2 （654 bp）大小相符，并且S1與S2有99%的同源性。由此可以初步判定，菌絲體S2為大球蓋菇子實體S1的純培養菌絲體。

2.5 系統發育分析

在NCBI中進行BLASTN比對，找到12條與S2相似性>90%的序列并下載，用ClustalX2.1軟件進行序列比對，并輔以人工修正。以靈芝（Ganoderma lucidum）作為外參，基于來自NCBI中的12個種的ITS序列，連同試驗中的 ITS 序列共14條序列一起用于系統發育分析。用MEGA 5.02中的鄰接法（NJ）構建系統樹。從圖2可以看出，S2與球蓋菇屬大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）系統發育關系最近。

3 結論與討論

對于野生食用菌的人工馴化，首先須要獲得純化菌種，常見的菌種分離方法有組織分離法、孢子分離法和基內菌絲分離法，其中組織分離法因簡單、易操作且純化率高，在實踐中被廣泛地應用[11]。本試驗采用組織分離法對野生大球蓋菇進行分離，試驗結果表明，野生大球蓋菇能夠成功分離獲得母種，并且子實體經2 h的晾曬，既能有效降低污染率，又不影響萌發和菌絲的生長，而長時間的晾曬則會嚴重抑制菌絲的萌發和生長?？赡苁墙涍^適宜時間的晾曬，子實體水分減少從而減少了細菌污染，再加上陽光中的紫外線具有殺菌功能，進一步降低污染，但長時間晾曬使子實體脫水，菌絲體細胞活力減弱甚至死亡，從而影響分離效果。大球蓋菇最佳的分離部位是菌蓋與菌柄交接處，該部位分離的菌絲生長速度快，長勢旺盛且污染率低，可能的原因是該部位是子實體的生長點，菌絲體細胞活力強，分裂速度快，且該部位與空氣接觸少，雜菌少。在食用菌工廠化生產中，液體菌種因其生產周期短、菌齡一致、菌種生產成本低、接種簡便等優點，得到了十分廣泛的應用[12]。本試驗篩選出最適宜的液體培養基配方為A2，即基礎液體培養基A1+蛋白胨15 g，采用此配方培養的液體菌種，菌絲體生物量高，菌絲球密度大，形態好。原因可能是此配方所含的蛋白胨中營養更豐富，氮的形態更適合菌絲體吸收。

目前菌種鑒定、遺傳多樣性研究主要基于形態學、細胞、生化及分子水平開展[13]，其中ITS序列分析法因準確性高，簡便易行而具有很大的應用價值。本試驗通過對供試子實體與菌絲體的ITS序列進行擴增、測序、比對，驗證了供試菌絲體為大球蓋菇子實體的分離物，構建系統發育樹后發現，分離獲得的純培養菌絲體與球蓋菇屬的大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）系統發育關系最近，與其同源性高達99%，確定為大球蓋菇菌種。

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