側柏和國槐幼苗生長對鉛脅迫的閾值

王榆鑫+王進鑫+初江濤

摘要：采用盆栽試驗研究側柏（Platycladus orientalis）、國槐（Sophora japonica）幼苗在適度供水（田間持水量的80%）條件下對重金屬鉛（Pb）的閾值反應，計算在適度供水條件下鉛對葉綠素含量、生物量、株高生長量、地徑生長量等的毒性閾值（ECx，x=10、50）。結果發現，低濃度的鉛對2個樹種所研究指標有促進作用，而高濃度的鉛則產生抑制作用。各指標中，側柏凈光合速率EC10為262 mg/kg，即對鉛的反應最為敏感；國槐對鉛最敏感指標為株高，株高生長量的EC10 為667 mg/kg。2個樹種葉綠素含量EC50最大，側柏、國槐分別為11 352、10 050 mg/kg，說明該指標對鉛抗性最強；其余指標對鉛耐性大小依次為生物量>株高>地徑。多指標綜合分析得出的閾值，EC10，國槐為1 526.79 mg/kg，EC10，側柏為1 731.62 mg/kg；EC50，國槐為9 104.59 mg/kg，EC50，側柏為6 414.73 mg/kg。以上結果表明，在適度供水條件下，國槐幼苗對鉛脅迫更為敏感且幼苗抗鉛性也強于側柏幼苗。

關鍵詞：側柏；國槐；鉛脅迫；閾值；生理毒性

中圖分類號：X503.235；X171.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0123-05

隨著礦產資源開發規模的不斷擴大，由此帶來的土壤重金屬污染問題日趨嚴重，其中鉛引起的污染尤為普遍。大量的鉛進入陸地表層生態系統，對土壤環境造成了嚴重污染，使得區域環境質量下降，給生態安全造成威脅。鉛是最常見的對人體和植物危害最大的重金屬之一[1]，可以通過植物根、莖或葉進入植物體并在其體內積累，當達到一定數量時，就會對其生長、生理生化造成不利影響[2-4]?；阢U污染的危害性和廣泛性，礦業開發后的廢棄地修復是環境保護工作中急需開展的任務之一[5]。

國內外有關土壤重金屬對植物的毒害效應及其閾值的研究結果表明，植物種類、生長狀態、土壤性質等對土壤重金屬的毒害效應及其臨界值都會產生影響[6-10]。在我國常用作物產量減少10%的土壤有害物質的濃度作為毒害臨界濃度[11-12]，即EC10 （10%有效抑制濃度）是建立基于風險的環境質量基準值的數據基礎[13]；目前對鋅[14]、汞[15]等污染物毒性閾值研究較多，閾值（ECx，x=10、50）表示引起指標10%或50%抑制效應時所對應的鉛濃度，關于土壤鉛對作物的毒害及閾值研究已經取得了良好的進展[16]，而對西北地區常見造林樹種側柏、國槐等閾值研究目前尚未見報道。本試驗研究了適度供水、不同鉛濃度條件下側柏和國槐幼苗各指標（葉綠素、株高、生物量等）的閾值大小，旨在揭示在適度供水及不同鉛濃度條件下國槐、側柏幼苗葉綠素、凈光合速率、生物量、地徑及株高的變化規律和2個樹種耐鉛性大小，為鉛礦業廢棄地植被恢復與土壤修復提供新的方法和技術參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試苗木為長勢一致的側柏、國槐幼苗，苗齡1年，所有苗木均來自陜西省楊陵地區附近苗圃。栽培基質為塿土（田間持水量22.3%，有機質含量13.70 g/kg，全氮含量 0.73 g/kg，速效磷含量35.90 mg/kg，速效鉀含量 96.52 mg/kg，鉛含量 18.41 mg/kg，pH值8.15），鉛試劑為分析純醋酸鉛Pb（CH3COO）2·3H2O。

1.2 試驗方法

試驗在西北農林科技大學南校區進行，采用旱棚的方法進行布設，2014年1月取風干土過篩，將Pb（CH3COO）2·3H2O充分攪拌均勻混合于土壤中，制成含不同濃度的鉛污染土壤，濃度分0（對照，CK）、300、500、1 000、2 000、4 000、6 000、8 000、10 000、12 000 mg/kg，分別將13 kg的土裝入直徑27 cm、高30 cm的塑料桶中，每個處理3盆，每盆2株供試植物，即每個處理共6個重復。于3月底栽植，澆灌一定體積的水，保證苗木成活，采用人工稱質量的方法控水，使各鉛處理的土壤含水量維持在田間持水量的80%（土壤質量含水量17.8%）。在整個試驗過程中，大棚內采用自然光照，栽培基質保持自然肥力。到9月中旬，測定凈光合速率、地徑、株高等指標，然后將2個樹種各處理植株進行收獲，測定生物量。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 葉綠素含量的測定 于9月14日進行葉綠素的測定，分別采集每個處理的6株側柏、國槐幼苗葉片，具體采集的部位是每株幼苗自上而下數的第5、第6個小分枝，再將采集的葉片混勻，然后隨機取樣；稱取0.5 g樣品，將所稱取的葉片用水洗凈，吸干水后放入研缽中，加入少量CaCO3、石英砂，加入10 mL乙醇丙酮混合液，將樣品充分研磨細碎直至變白，然后將其過濾，得到葉綠素的提取液；將過濾后的提取液用乙醇丙酮混合液定容至100 mL，用紫外分光光度計測定定容后的提取液的吸光度D663 nm、D645 nm。

1.3.2 凈光合速率（Pn）的測定 采用Li-6400光合測定儀對凈光合速率進行測定，在室外自然光照下測定，為減少每次測定時自然環境因子誤差，于9月12日進行凈光合速率的測定，測定時間為09：00—11：00，選取長勢良好，樹冠上部向陽的葉片進行測定。

1.3.3 生長指標的測定 分別于2014年3月栽植后，2014年9月收獲前各測定1次側柏和國槐的株高和地徑；于2014年9月收獲后測定側柏和國槐的生物量。

（1）株高（新稍長度）。采用米尺（精確度0.001 m）測量。（2）地徑。采用數顯游標卡尺（精度0.01 mm）測量。（3）生物量。收獲后，將側柏、國槐植株根、莖、葉分開，洗凈后在105 ℃殺青 30 min，70 ℃恒溫烘至恒質量后稱質量，得到各部分的生物量。

1.4 數據處理及閾值的確定

采用Microsoft Excel軟件對所測的6個重復數據進行整理并取平均值，再進行作圖，運用SPSS 19.0軟件進行回歸方程的擬合和差異顯著性分析。通過建立數學模型來尋找污染物閾值[17]，以土壤Pb濃度和各指標（葉綠素含量、株高、地徑等）為對象，采用回歸分析的方法，建立土壤Pb含量（x）與各指標（y）的線性、多項式、對數、乘冪、指數5個回歸模型，并進行篩選。通過比較各方程的決定系數（r2）和相關顯著性檢驗（P值），確定采用擬合性最高（最大r2值和最小P值）的回歸方程為擬合公式，進而求得各指標的EC10、EC50，最后利用SPSS軟件中的因子分析確定各個指標的權重，對2個樹種耐鉛能力進行綜合評價。權重具體計算公式如下[18]：

2 結果與分析

2.1 重金屬鉛對葉片葉綠素的毒害效應閾值

鉛能破壞葉綠素和葉綠體的結構，從而破壞葉綠素合成過程并影響葉綠素合成酶的活性[19]，因而葉綠素含量已成為評價植物受到逆境傷害的重要生物學指標。以土壤Pb含量為因變量，以葉綠素含量為自變量，采用回歸分析方法建立土壤Pb含量（x）與葉綠素含量（y）的多項式回歸模型（圖1）。

在適度供水條件下，國槐、側柏幼苗葉片葉綠素含量變化的總體趨勢是：隨著鉛含量的增加而降低，當鉛含量為 12 000 mg/kg 時，葉綠素含量最低，國槐、側柏分別為6.65、4.79 mg/g。側柏在鉛含量為1 000 mg/kg時葉綠素含量與對照相比增加了6.3%，說明低含量的鉛對葉綠素的合成具有一定的促進作用（圖1）。通過回歸方程可求得國槐葉綠素的EC10為1 165 mg/kg，側柏葉綠素的EC10為4 586 mg/kg，可見2個樹種葉綠素含量的EC10相差較大，且側柏EC10大于國槐EC10，就葉綠素含量這一指標國槐對鉛脅迫反應更敏感；國槐葉綠素含量的EC50為10 050 mg/kg，側柏葉綠素含量EC50為11 352 mg/kg，即幼苗葉片葉綠素含量ECx為：側柏>國槐，同一含量下鉛脅迫對于葉綠素含量的影響側柏小于國槐。

2.2 重金屬鉛對葉片凈光合速率（Pn）的毒害效應閾值

對土壤重金屬Pb含量與幼苗葉片凈光合速率（Pn）之間的關系（圖2）進行模擬分析可以看出，國槐、側柏Pn隨土壤鉛含量變化趨勢大致相同。鉛含量為0～2 000 mg/kg范圍內，2個樹種Pn下降較快，說明在這一范圍內鉛對葉綠素結構破壞嚴重；而鉛含量2 000～6 000 mg/kg時，Pn下降趨勢相對平緩，可能是因為葉綠素結構已經被破壞，所以Pn維持在一個相對較低的水平。通過計算發現，國槐Pn的EC10為 1 136 mg/kg，側柏Pn的EC10為265 mg/kg，說明在Pn這一指標上，側柏較國槐更為敏感；國槐Pn的EC50為4 629 mg/kg，側柏Pn的EC50為2 202 mg/kg，表明同一鉛含量對國槐幼苗Pn的影響要小于對側柏幼苗的影響。

2.3 重金屬鉛對幼苗地徑、株高的毒害效應閾值

地徑、株高生長量均是反映植物生長狀況的重要指標。隨著鉛含量的增加，側柏、國槐幼苗地徑生長量逐漸減小，側柏地徑生長量變化趨勢與其葉綠素含量變化趨勢類似，當鉛含量為12 000 mg/kg時，地徑生長量僅為0.54 mm，為對照的 13.74%；對于國槐在鉛濃度為0～4 000 mg/kg范圍內，地徑生長量明顯下降，說明在這一含量范圍內，重金屬鉛對國槐地徑生長量影響較大。通過擬合方程，求得國槐生長量EC10為914 mg/kg，EC50為9 620 mg/kg；側柏生長量EC10為 1 803 mg/kg，EC50為5 730 mg/kg （圖3）。

鉛脅迫下，側柏、國槐幼苗株高生長量隨著鉛含量的增加逐漸降低，變化趨勢與地徑生長量基本一致（圖4）。在土壤鉛含量為12 000 mg/kg時，側柏、國槐幼苗株高生長量分別為對照的31.84%、44.64%，國槐幼苗株高生長量的EC10為 667 mg/kg、EC50為9 680 mg/kg；側柏幼苗株高生長量EC10為1 509 mg/kg，EC50為5 937 mg/kg。以上結果表明，國槐幼苗株高生長量較側柏對鉛更為敏感。

2.4 重金屬鉛對生物量的毒害效應閾值

土壤鉛含量與側柏、國槐的葉、根、莖的生物量成反比（圖5、圖6）。當鉛含量為12 000 mg/kg時，側柏和國槐的總生物量為17.02、55.32 g，分別是對照的35.67%、42.76%。但在較低的鉛含量范圍內，即當鉛含量為500 mg/kg時，側柏葉的生物量為24.08 g，比對照增加3.88%；當鉛含量為 1 000 mg/kg 時，國槐莖的生物量為32.33 g，比對照增加了30.56%。這說明低含量的鉛對這2個樹種生長有一定促進作用，與葉綠素含量的變化規律類似。對側柏來說，莖的生物量EC10為388 mg/kg，對鉛反應最為敏感，根的生物量EC50為 11 720 mg/kg；生物量EC10為：國槐>側柏，總生物量EC10側柏為744 mg/kg，國槐為2 692 mg/kg；總生物量EC50側柏為 7 871 mg/kg，國槐為9 722 mg/kg，總生物量EC50為：國槐>側柏（表1）。

2.5 重金屬鉛對2樹種毒害效應閾值的綜合分析

運用SPSS 19.0軟件對鉛脅迫條件下2個樹種的指標葉綠素含量、凈光合速率、生物量、地徑生長量、株高生長量EC10及EC50進行主成分分析（表2至表5）， 提取累積貢獻率大于80%的主成分，并計算權重，通過表2、表3可求得2個樹種的綜合EC10；通過表4、表5得到2個樹種的綜合EC50。

將綜合模型式（14）系數歸一化，得到各指標權重，即指標集（葉綠素含量EC50，凈光合速率EC50，生物量EC50，株高生長量EC50，地徑生長量EC50）對應的權重集為（0.093，0.119，0.245，0.280，0.263）。根據各個指標的權重，計算出側柏、國槐的綜合EC50值分別為6 414.73、9 104.59 mg/kg。

3 結論與討論

本試驗在前人研究的基礎上探討重金屬鉛對國槐和側柏葉綠素含量、生物量、株高等的毒性閾值，結果表明，鉛含量較低時對葉綠素的合成有一定促進作用；隨著含量繼續增加，對葉綠素的合成表現為抑制，這與徐勤松等的研究結果[20]基本一致。側柏葉綠素EC10大于國槐，說明側柏葉綠素對鉛脅迫的敏感性要比國槐??；凈光合速率的變化趨勢與葉綠素類似。高含量的Pb破壞葉綠素的合成過程是通過使葉綠素酸酯還原酶的活性降低和減少氨基-r-酮戊酸的合成實現的，因為這2樣都是合成葉綠素所必需的物質，植物的葉綠素含量少了，凈光合速率也隨之降低[21]；而Kupper等則認為，重金屬鉛影響光合作用的機理是Pb2+取代了葉綠素分子中的Mg2+，使葉綠素的結構破壞，進而對光合作用的正常進行產生影響，導致凈光合速率下降；有關重金屬鉛影響光合作用的機理，還需要進一步的深入研究[22]。側柏葉綠素含量EC10為國槐EC10的3.9倍，而側柏凈光合速率EC10僅為國槐的 23.06%，可能原因是國槐光能利用率更高[23]。

逆境條件下，植物能夠通過調整自身的形態特征最大程度地減少環境對其生長發育的影響。大量研究表明，一定含量范圍內的鉛能刺激一些植物生長，當鉛含量超過一定值時就會對植物造成傷害，如生長衰退等，且含量越高，抑制作用越明顯[24-26]，植物的生物量、株高、地徑與其生長發育、營養物質的形成密切相關。由圖5、圖6可知，重金屬鉛會抑制側柏、國槐生物量的增加，在根、莖、葉各部分生物量中，鉛對側柏莖生物量的抑制作用最大，當鉛含量為 12 000 mg/kg 時，莖生物量僅為對照的31.03%；同樣鉛含量下，對國槐葉生物量抑制最大，此時葉生物量為對照的 40.81%。從圖3、圖4可以得出，側柏株高、地徑生長量EC10均小于國槐，同種樹株高、地徑生長量EC10比較，株高大于地徑，地徑對鉛耐性不如株高。運用主成分分析，并計算權重，最后得到綜合EC10，國槐為1 526.79 mg/kg，EC10，側柏為 1 731.62 mg/kg；EC50，國槐為 9 104.59 mg/kg，EC50，側柏為 6 414.73 mg/kg，此結果表明在適度供水條件下，國槐幼苗對鉛脅迫更為敏感，且幼苗抗鉛性強于側柏幼苗。

本試驗未能找出鉛對2種樹幼苗的致死閾值，可能和所施加的鉛試劑有關，楊楠通過運用不同鉛制劑處理側柏種子，側柏幼苗莖長EC50在醋酸鉛和硝酸鉛作用時分別為 9 690、4 390 mg/kg，即同等條件下，相同含量的硝酸鉛對側柏影響更大；也可能是所加鉛試劑濃度未能達到兩者的致死濃度，還需要在以后的試驗中設計更高的鉛試劑濃度或更換其他的鉛試劑如硝酸鉛做進一步研究[27]。

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