利用地塞米松構建建鯉肝切片脂變模型

王濤+曹麗萍+杜金梁

摘要：用地塞米松構建建鯉肝切片脂變模型，并探索最佳建模濃度，初步探究地塞米松致建鯉肝臟脂變的作用機理。建鯉活體取肝，用振蕩切片機制備厚度為300 μm的建鯉肝切片，27 ℃培養箱中預培養2 h。將試驗分為試驗組和空白對照組，試驗組用含濃度為0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L地塞米松的L-15培養基于 27 ℃ 培養箱中培養12 h，空白對照組用L-15培養基培養相同時間，培養結束后，收集試驗組和空白對照組中上清液和肝切片。參照試劑盒說明檢測上清液中谷丙轉氨酶（GPT）、谷草轉氨酶（GOT）活性，肝切片勻漿中三磷酸腺（ATP）、總蛋白（TP）含量，甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）含量以及脂肪酸合成酶（FAS）活性。結果顯示，建鯉肝切片經地塞米松誘導后，ATP含量變化不大；當地塞米松濃度為3.93 mg/L時，試驗組的其他指標與空白對照組差異極顯著（P<0.01）。由此說明，用濃度為3.93 mg/L地塞米松誘導建鯉肝切片12 h可以成功構建建鯉肝切片脂變模型。

關鍵詞：建鯉；肝切片；地塞米松；脂變；脂肪肝；糖皮質激素

中圖分類號： S941.8 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0146-04

肝臟作為生物體內的重要器官，在能量代謝和物質循環中具有重要作用，同時也是蛋白質、脂肪合成的重要場所[1]。近年來，隨著水產養殖的迅速發展，魚類脂肪肝和肝腫大普遍存在，但目前還沒有較好的治療方法，患病魚類品質下降，抗病能力降低，嚴重影響水產養殖健康持續發展。魚類脂肪肝的成因復雜，普遍認為，養殖條件下投喂營養不均衡的配合飼料（如高糖、高脂）以及養殖期間投喂過量，造成肝臟脂類物質代謝發生障礙，脂肪沉積于肝臟的速度遠遠超過脂肪轉移的速度，導致甘油三酯在肝細胞內異常沉積[2]。然而，有關高等哺乳動物的研究表明，脂肪肝的形成與糖皮質激素慢性升高有密切聯系[3]。許多研究證實，糖皮質激素影響肝臟脂肪代謝，誘導脂肪肝和肝腫大[4-6]；過多的脂肪沉積是糖皮質激素造成脂肪肝和肝腫大的主要原因[7]。

集約化養殖條件下，魚類受多種應激因子刺激。當應激原存在時，下丘腦-腦垂體-腎間組織軸受到刺激，使促腎上腺皮質激素（adreno cortico tropic hormone，簡稱ACTH）分泌增加，ACTH作用于腎間組織，從而引起糖皮質激素（皮質醇）分泌增加，導致血液中糖皮質激素含量升高[8]。急性應激常常導致皮質醇含量數倍甚至數十倍地增加，而慢性應激（如高密度養殖時的擁擠脅迫等）則使血液中皮質醇含量在數周后仍然保持較高水平，但也有皮質醇在1周后恢復到正常水平[9]。

本試驗用不同濃度的地塞米松模擬魚體內不同含量的糖皮質激素，恒溫培養的建鯉肝切片模擬魚體內肝臟，構建由地塞米松引起的建鯉肝臟脂變模型。目前，用地塞米松構建肝臟脂變模型并不陌生，國內外學者單獨或與高脂飲食并用構建小鼠急性脂肪肝模型，但主要集中在陸生動物上，對水生動物研究較少。殷國俊等將孵化出96 h的斑馬魚暴露在添加50 mg/L地塞米松的水中，經過24 h后，斑馬魚的肝臟顯著增大了40%，此階段的斑馬魚是卵黃囊為內源性營養，表明地塞米松在沒有外源性營養的情況下，可以誘導斑馬魚的肝腫大（注：相關試驗尚未公開發表）。劉英娟等單獨使用四氯化碳成功構建鯉魚肝細胞脂變模型，用該模型成功篩選出護肝中藥枸杞多糖[10]；盧榮華等用脂肪乳劑成功構建草魚肝細胞脂變模型[11]；國外學者在青鳉魚上成功構建肝臟脂變模型，并用該模型成功篩選出護肝藥物[12]。該試驗通過地塞米松誘導建鯉肝切片12 h后，成功構建建鯉肝臟脂變模型，為篩選相關治療藥物提供理論模型。

1 材料與方法

1.1 試驗用魚

試驗用建鯉取自中國水產科學院淡水漁業研究中心漁場，體質健康無病。將建鯉放入循環水系統暫養1周，養水溫度為25 ℃，每天定時定量投喂商品飼料。

1.2 主要試劑和儀器

地塞米松（dexamethasone）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，簡稱DMSO），購于美國Sigma公司；谷丙轉氨酶（glutamate pyruvic transaminase，簡稱GPT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，簡稱GOT）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，簡稱ATP）、總蛋白（total protein，簡稱TP）、甘油三脂（triglyceride，簡稱TG）、總膽固醇（total cholesterol，簡稱TC）、游離脂肪酸（free fatty acids，簡稱FFA）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，簡稱FAS）等試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；振蕩切片機、723分光光度計，購自上海欣茂儀器有限公司；酶標儀MK3，購自美國Thermo公司。

1.3 建鯉肝切片的制備與培養

無菌條件下，建鯉消毒麻醉后，超凈臺內取出肝臟并置于PBS緩沖液中，持續通入含95% O2、5% CO2的混合氣體。用PBS緩沖液清洗肝組織3次后，用解剖刀處理成體積為0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的肝組織塊，2%的低熔點膠包埋，30 min后固定肝組織，振蕩切片機制備厚度為300 μm的肝切片。將上述肝組織切片置于含1 mL L-15培養基的24孔板中。

1.4 試驗設計

本試驗設試驗組和空白對照組，每組4個重復；試驗前，各組用L-15培養基27 ℃恒溫箱中預培養2 h后，吸棄上清?？瞻讓φ战M換用新鮮L-15培養基繼續培養12 h，試驗組用含濃度為0.039 3、0.393 0、3.930 0、39.300 0、393.000 0 mg/L 地塞米松的L-15培養基培養相同時間，試驗結束后收集上清液和肝切片。

1.5 建鯉精密肝切片活力檢測

建鯉肝切片經地塞米松誘導12 h后收集并稱其質量，加入9倍體積的沸雙蒸水，制成10%的組織勻漿，沸水中煮 10 min，3 500 r/min離心10 min，取上清液，按ATP測試盒說明書測定三磷酸腺苷含量。

1.6 生化指標測定

地塞米松誘導建鯉肝切片12 h后，收集上清液和肝切片。按試劑盒說明書分別測定TP、FFA、TG、TC的含量，GPT、GOT、FAS活性。

1.7 數據分析

試驗數據用SPSS 22.0進行整理分析。采用One-Way ANOVA檢驗法進行顯著性分析，結果以“平均值±標準差”表示。其中，在0.01水平上差異顯著用“**”表示，在0.05水平上差異顯著用“*”表示。

2 結果與分析

2.1 地塞米松對建鯉肝切片活性的影響

由圖1可知，建鯉肝切片經地塞米松誘導12 h后，試驗組與空白對照組相比，ATP含量雖然有所降低但差異不顯著（P>0.05）。由此推斷，在該濃度劑量范圍內，地塞米松對建鯉肝切片活性的影響較小。

2.2 地塞米松對建鯉肝切片抗氧化能力的影響

由圖2可知，隨著地塞米松濃度的增加，超氧化物歧化酶的活性先降低，然后保持相對穩定。當地塞米松濃度超過0.393 0 mg/L時，試驗組與空白對照組差異顯著（P<0.01）；當濃度超過3.93 mg/L后超氧化物歧化酶活性保持相對穩定。

2.3 地塞米松對建鯉肝切片中總蛋白含量的影響

由圖3可知，隨著地塞米松濃度的增加，總蛋白含量先逐漸降低后保持相對穩定，當濃度達到3.930 0 mg/L時，總蛋白含量達到最低點；超過該濃度，總蛋白含量保持相對穩定。

2.4 地塞米松對建鯉肝切片中GPT、GOT活性影響

如圖4可知，GPT、GOT的活性隨著地塞米松濃度的升高，先增加后保持相對穩定，在濃度為0.393 0 mg/L時，試驗組與空白對照組差異顯著（P<0.05）；地塞米松濃度達到并超過3.930 0 mg/L時，GPT、GOT的活性保持相對穩定。

2.5 地塞米松對建鯉肝切片中游離脂肪酸（FFA）含量、脂肪酸合成酶（FAS）活性的影響

如圖5可知，試驗組與空白對照組相比，當地塞米松濃度為0.393 0 mg/L時，建鯉肝切片勻漿中FFA含量和FAS的活性均出現差異顯著性（P<0.05）；當地塞米松濃度為3.930 0 mg/L 時差異顯著（P<0.01），超過該濃度時FFA含量和FAS活性均保持相對穩定。

2.6 地塞米松對建鯉肝切片勻漿中TC、TG含量的影響

由圖6可知，建鯉肝切片中TC、TG的含量隨著地塞米松濃度的增加先增加后保持穩定，當地塞米松濃度達到0.393 0 mg/L 時，試驗組與空白對照組TC、TG含量差異顯著（P<0.05）；濃度達到并超過3.930 0 mg/L后，TC、TG含量達到最大值且保持相對穩定。

3 討論

生物體內三磷酸腺苷（ATP）作為能量轉換載體，ATP含量變化直接影響器官的能量代謝[13]。因此，試驗中將ATP含量作為評價器官活性的重要指標。從圖1可以看出，試驗組較空白對照組相比ATP含量有所降低，但差異并不顯著（P>0.05）。由此可以推斷，建鯉肝切片經地塞米松誘導后活性依然良好。試驗組ATP降低可能是因為地塞米松上調磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，簡稱PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，簡稱G-6-pase）的表達，促進糖異生，并降低組織細胞對葡萄糖利用效率，抑制線粒體合成ATP[14]。但從本試驗的結果可以推測這種抑制作用是有限的，試驗中的建鯉肝切片活性良好。

SOD作為機體內重要的抗氧化酶[15]，能有效清除機體內超氧化物自由基，有效防止自由基對機體的損害。圖2顯示，隨著地塞米松濃度的增加，試驗組中SOD的活性先逐漸降低，然后保持相對穩定，在濃度為0.393 0 mg/L時，試驗組與空白對照組差異顯著（P<0.05），當濃度達到并超過3.930 0 mg/L 時，SOD活性保持相對穩定。

GPT和GOT是內源性轉氨酶，因此常常通過檢測細胞培養上清液中GPT和GOT活性來判斷細胞受損程度[16]。本試驗中GPT和GOT的活性先是隨著地塞米松濃度的增加而增加，當濃度達到3.930 0 mg/L時活性達到最大且保持相對穩定。說明地塞米松對建鯉肝切片造成了一定的損傷，這種損傷可能與地塞米松促進磷脂氧化，增強脂質過氧化連鎖反應，增加質膜的流動性，改變細胞膜的通透性有關。

肝臟在蛋白質的合成與分解過程中具有重要的調節作用，動物血漿中的蛋白質幾乎全部在肝臟中合成。當肝臟受到外界刺激發生損傷后，功能發生紊亂，蛋白質的合成受阻[17-18]。本試驗中建鯉肝切片經地塞米松誘導12 h后，試驗組與空白組相比，蛋白質含量變化明顯。導致該試驗結果的主要原因可能是地塞米松影響單個核糖體組裝成多聚核糖體的效率，降低翻譯能力，進而減弱蛋白質合成相關基因的表達而降低蛋白質的合成[19]。不僅如此，地塞米松通過激活肝細胞內溶酶體和泛素蛋白酶體蛋白水解途徑促進蛋白質降解[20]。由圖3可以看出，當地塞米松濃度達到3.930 0 mg/L時，蛋白質含量達到最小值，超過該濃度，蛋白質含量保持相對穩定。說明該濃度的地塞米松能有效抑制肝臟對蛋白質的合成，促進蛋白質的分解。

肝臟不僅在蛋白質代謝過程中起重要作用，而且與脂肪代謝密切相關。已有研究證實，地塞米松可以提高肝X受體（1iver X receptors，簡稱LXRs）mRNA基因的表達，肝X受體合成分泌增加[21]。肝X受體上調固醇調節元件結合蛋白（sterol-regulatory element binding proteins，簡稱SREBPs）基因的表達，從而間接促進脂肪酸合成相關基因FAS、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，簡稱ACC）基因的表達[22]。也有研究人員發現，地塞米松能增加體外培養細胞中FAS的活性，直接促進脂肪酸合成的作用[23]，在本試驗中由圖5-b可知，建鯉肝切片經地塞米松誘導后，FAS活性明顯上升，并隨著地塞米松濃度的增加而逐漸增強，在濃度為 3.930 0 mg/L 時達到最大值，之后保持相對穩定。

正常情況下，肝臟中的FFA脂化為TG，蛋白質與TG結合成脂蛋白，然后轉運出肝臟參與血液循環[24]；TC則一部分氧化生成膽汁進入膽囊，另一部分與蛋白質結合后以低密度蛋白和高密度蛋白的形式轉運出肝臟參與血液循環[25]。本試驗中，由于地塞米松對建鯉肝切片的誘導作用，FAS合成分泌增加，導致肝臟中FFA含量升高，過多的FFA對肝臟具有毒害作用，而造成“初次打擊”[26]；此外，FFA通過線粒體β氧化產生過氧化物ROS，再次對肝臟產生毒害作用而產生“二次打擊”[27]。在地塞米松濃度達到3.930 0 mg/L后，建鯉肝切片因遭2次“打擊”受損程度最為明顯，試驗組與空白對照組差異顯著（P<0.01）。此外，肝臟中的TG含量隨FFA含量增加而增加，TC含量也隨肝臟中蛋白質的減少而增加。肝臟中FFA、TG、TC含量異常變化最終導致肝臟脂肪代謝異常而脂變，甚至演變成脂肪肝。

4 結論

通過本試驗得出如下結論：地塞米松對蛋白質、脂肪代謝具有重要調節作用。用濃度為3.930 0 mg/L地塞米松誘導建鯉肝肝切片12 h能成功構建建鯉肝切片脂變模型。

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