鐵對紫球藻生長及可溶性蛋白和胞外多糖含量的影響

谷兵+張達娟+王沂

摘要：通過研究不同鐵離子濃度條件下紫球藻的比生長率、主要葉綠素含量、可溶性蛋白及胞外多糖含量的變化情況，來闡述鐵離子對紫球藻生長的影響。結果表明，添加不同濃度的Fe3+對紫球藻的生長有明顯的促進作用；Fe3+濃度在5×10-7～5×10-5 mol/L范圍內時，紫球藻的生長和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖的積累隨Fe3+濃度的升高而增加，當Fe3+濃度為5×10-4 mol/L時，紫球藻的生長較為緩慢，其細胞密度略低于其他處理及對照組，且上述各指標均與5×10-5 mol/L處理組之間無顯著差異。因此，紫球藻培養中鐵的最適添加濃度約為5×10-5 mol/L。

關鍵詞：紫球藻；鐵；可溶性蛋白；胞外多糖

中圖分類號： S968.43+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0159-04

鐵是浮游植物的微量營養元素和催化元素，是浮游植物生長的關鍵限制因子之一，影響著浮游植物的電子傳遞、氧的新陳代謝、氮的吸收利用、呼吸作用和光合作用[1]，且在海洋“生物泵”循環過程起著關鍵作用[2]。20世紀30年代初，研究學者提出鐵是海洋浮游植物生長的潛在性限制因子[3-6]。李麗研究了鐵離子對三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）、小球藻CS-01（Chlorella sorokiniana CS-01）和等鞭金藻（Isocrydid galbana）生長和脂質積累的影響，發現鐵對這3株微藻的生長和脂質積累均有促進作用，同時還比較研究了鐵、鎂、銅、鈣對小球藻生長和脂質積累的影響，其中鐵離子的影響最為顯著[7]。王培磊等研究了鐵對鹽生杜氏藻（Dunaliella salina）生長和β-胡蘿卜素積累的影響，結果表明，較高濃度的鐵有利于其β-胡蘿卜素的積累[1]。

紫球藻（Porphyridium cruentum）細胞呈圓形或卵圓形，外披黏質的鞘膜，隸屬于紅藻門（Rhodophyta）原紅藻綱（Protofloridcophyceac）紫球藻目（Porphyridiales）紫球藻科（Porphyridiaceae）紫球藻屬（Porphyridium），是紅藻門中唯一的單細胞藻類，紫球藻廣泛分布于海水、淡水、咸水及潮濕的土壤中[8]。關于紫球藻的研究主要集中在培養工藝的優化改良和多種生物活性物質的開發利用方面[9]。已有相關文獻研究表明[10]，基于藻類的光合作用效率和生長潛能，1 hm2大小的土地理論上計算可以生產超過30 000 L，即200桶油的量，相當于同樣土地上大豆產油量的100倍，而紫球藻生長快、繁殖周期短，且抗鹽性強，具廣闊的應用前景及較大的潛在市場。本研究主要探討了不同濃度的鐵離子對紫球藻比生長率和葉綠素a、β-胡蘿卜素、可溶性蛋白、胞外多糖含量的影響，以期為進一步探討紫球藻的培養條件以及生物活性物質的提取提供有益參考。

目前，國內外關于海藻多糖的研究主要集中在其組成、結構分析、生理活性及藥理試驗等方面，而對于影響或促進海藻多糖合成和分泌的外界物理因子的研究相對比較少。

1 材料與方法

1.1 試驗藻種

紫球藻藻種，由中國科學院水生生物研究所藻種庫提供。

1.2 培養條件

試驗采用f/2培養基，以自然光照為光源，光—暗周期為12 h—12 h，光照度為2 000～2 500 μmol/（m2·s），培養溫度為（27±2） ℃。設置對照組和4個處理組，處理組培養基中鐵離子濃度分別為5×10-7、5×10-6、5×10-5、5×10-4 mol/L，每組分別設置3個平行，按10%的量接種紫球藻液，試驗進行培養周期為14 d，每2 d取樣1次測定相關指標。

1.3 各項指標的測定及方法

1.3.1 紫球藻比生長率的測定 用血球計數板記錄紫球藻細胞數，每個重復均需要測定后取平均數。

相對生長率=ln（X2-X1）/（T2-T1）。

式中：X1和X2分別代表T1和T2時紫球藻細胞的濃度。

1.3.2 葉綠素a的提取與測定 參考韓娟等的方法[11]，取紫球藻液，4 500 r/min離心5 min，棄上清液，藻團中加入甲醇振蕩混勻，70 ℃水浴振蕩5 min，自然冷卻后4 500 r/min離心5 min取上清液，即為紫球藻葉綠素a提取液，1 cm光徑下測定750、665 nm波長處的吸光度。

葉綠素a含量=13.9×（D665 nm-D750 nm）×V1/V2。

式中：V1為最終體積，V2為取樣體積，13.9為相關系數。

1.3.3 β-胡蘿卜素的提取與測定 參考劉建國等的方法[12-13]，取紫球藻液，4 000 r/min離心15 min，棄上清液，將藻團轉入到研磨器中，加入80%的丙酮溶液，研磨均勻，4 000 r/min 離心15 min，取上清液至容量瓶中，再將沉淀轉入研磨器中，重復上述操作，合并所有上清液并定容，450 nm 波長、1 cm光徑測定吸光度。

β-胡蘿卜素含量=[D450 nm×稀釋倍數×10×1 000]÷2 500。公式中，10為所取藻液的體積，1 000為單位換算值，2 500 為β-胡蘿卜素系數。

1.3.4 水溶性蛋白的測定

1.3.4.1 蛋白質標準曲線的制作 準確稱取100 mg的牛血清蛋白溶于少量的無菌水中，并定容至100 mL容量瓶中，配制成1 000 μg/mL的母液，再分別稀釋制成不同濃度的蛋白質標準溶液（表1），分別吸取0.5 mL蛋白質標準溶液置于 20 mL 的比色管中，加入5 mL考馬斯亮藍G-250蛋白試劑，反應2 min后在1 cm光徑、595 nm波長處測定溶液的吸光度（表1），然后以蛋白質濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制蛋白質標準曲線（圖1）。

1.3.4.2 可溶性蛋白的提取與測定 取紫球藻液，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，分別用無菌水和 10 mmol/L、pH=6.8的磷酸鹽緩沖液沖洗藻團1次，再將藻團轉入到研缽中，并加入少許磷酸鹽緩沖液和0.05 g二氧化硅，在冰浴下充分研磨，5 000 r/min離心10 min，取上清液，即為可溶性蛋白的粗提取物，采用Bdarofdr法[14]測定其蛋白含量。

1.3.5 多糖含量的測定

1.3.5.1 多糖標準曲線的制作 準確稱取100 mg葡萄糖（烘干至恒質量），溶于少量的無菌水中，并定容至100 mL容量瓶中，制成1 000 μg/mL的母液，再分別稀釋制成不同濃度的標準溶液（表2）。以苯酚-硫酸法測定葡萄糖含量，取標準溶液各1 mL，冰水浴一段時間后加入1 mL 6%的苯酚溶液，隨即加入5 mL的濃硫酸，反應完全后在水浴鍋中加熱 20 min 使其充分反應，自然冷卻后490 nm波長、1 cm光徑測定吸光度（表2），以標準液濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制多糖標準曲線（圖2）。

1.3.5.2 紫球藻多糖的制備與含量的測定 取紫球藻液，5 000 r/min 離心10 min，棄上清液，向藻細胞團中加入 0.01 mol/L 的乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液，在磁力攪拌器上攪拌45 min，再加入同倍體積20%的三氯乙酸（TCA）溶液脫蛋白，4 ℃靜置過夜，5 000 r/min離心10 min，取上清液加入3倍體積的無水乙醇，4 ℃醇沉過夜，5 000 r/min離心 10 min，去上清液，將沉淀物裝入透析袋（透過分子量8 000），在無菌蒸餾水中透析24 h，透析后的溶液即為提取的多糖溶液。以無菌蒸餾水作為空白對照，用苯酚-硫酸法測定樣品多糖含量。

1.3.6 數據分析 試驗結果均用平均值±標準差的形式表示，在統計軟件SPSS 17.0中利用單因素方差分析（one-way ANOVA）對數據進行分析比較，標有不同小寫字母者表示組間有顯著差異（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 不同濃度Fe3+對紫球藻生長的影響

由圖3可知，各組紫球藻的生長趨勢基本相同，接種后各組的藻細胞都處于靜止適應狀態，從培養6 d開始，紫球藻進入對數生長階段，生物量不斷增大，培養10 d紫球藻基本達到穩定期，生長速度減慢。從紫球藻比生長率（表3）來看，紫球藻的生長狀況為處理組2>處理組3>處理組1>對照組>處理組4。Fe3+濃度在5×10-7～5×10-5 mol/L范圍內時對紫球藻的生長具有促進作用，以5×10-6 mol/L的Fe3+對紫球藻的生長促進作用最大，其次是5×10-5 mol/L。5×10-4 mol/L 的Fe3+抑制了紫球藻的生長。

2.2 不同濃度Fe3+對紫球藻葉綠素a含量的影響

由圖4可知，紫球藻葉綠素a的含量在接種后基本保持不變，隨細胞濃度升高，葉綠素a的含量在培養6 d后逐漸升高，在培養10 d基本穩定，隨后Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L 的處理組紫球藻葉綠素a含量還持續升高。單因素方差分析結果表明，在培養的前6 d，各處理組的葉綠素a含量差異不顯著（P>0.05），自培養8 d開始，5×10-5 mol/L處理組中紫球藻葉綠素a的含量顯著高于其他處理組及對照組（P<0.05）。

2.3 不同濃度Fe3+對紫球藻β-胡蘿卜素含量的影響

由圖5可知，紫球藻β-胡蘿卜素含量在接種后的一段時間里基本保持不變，隨細胞濃度升高，培養6 d后β-胡蘿卜素含量逐漸升高，但Fe3+濃度為5×10-4、5×10-5 mol/L的處理組β-胡蘿卜素含量升高的速率比對照組和Fe3+濃度為5×10-6、5×10-7 mol/L的處理組快。單因素方差分析結果表明，在培養的前6 d，各處理組的β-胡蘿卜素含量差異不顯著（P>0.05），自培養8 d開始，5×10-5 mol/L處理組中紫球藻β-胡蘿卜素含量顯著高于其他處理組及對照組（P<0.05）。

2.4 不同濃度Fe3+對紫球藻可溶性蛋白含量的影響

由圖6可知，在培養的前8 d，各處理組可溶性蛋白含量與對照組無顯著差異（P>0.05），在培養10 d，Fe3+濃度為 5×10-5 mol/L處理組的紫球藻可溶性蛋白含量顯著高于其他處理組及對照組（P<0.05），在培養12、14 d，各處理組的可溶性蛋白含量與對照組相比均有顯著升高（P<0.05），添加不同濃度的Fe3+可以有效地促進紫球藻可溶性蛋白的分泌。

2.5 不同濃度Fe3+對紫球藻胞外多糖積累的影響

由圖7可知，紫球藻胞外多糖含量在接種后的一段時間里基本保持不變，隨細胞濃度升高，從培養8 d開始，胞外多糖含量逐漸升高，在培養10 d基本達到穩定。在培養的前 8 d，對照組與各處理組的胞外多糖含量差異不顯著（P>0.05），自培養8 d開始，各處理組胞外多糖含量出現差異，但差異不顯著（P>0.05），在培養10、12、14 d，各處理組與對照組的胞外多糖含量幾乎保持穩定，但添加Fe3+的濃度越高，紫球藻胞外多糖的積累量越多。

3 討論

相關研究表明，Fe對藻類的影響不僅取決于Fe的含量，更重要的是取決于它轉化成生物活性形式的速度以及藻類的有效吸收[1]。本試驗研究表明，不同Fe3+濃度下紫球藻的生長趨勢基本相同，在試驗所涉及的Fe3+濃度范圍內，隨著Fe3+濃度升高，生長促進作用逐漸增強，但并不是Fe3+濃度越高越好，適量的Fe3+（5×10-6、5×10-5 mol/L）會促進紫球藻的生長，但Fe3+濃度增加到一定濃度（5×10-4 mol/L）后，紫球藻細胞的促進作用開始減弱，甚至抑制了紫球藻的生長。Fe3+濃度高抑制了紫球藻細胞生長的原因可能為Fe3+過高時，藻類光合作用效率下降，表現在葉綠素a含量的下降、細胞變小、細胞分裂率和生長率均下降[1]。劉丹楹等指出，紫球藻生長的最適Fe3+濃度為1×10-5 mol/L，其次為 5×10-6 mol/L[14]，本試驗結果與之相似。由此可見，最適紫球藻生長的Fe3+濃度為1×10-5～5×10-5 mol/L，這為實際生產提供了數據參考。

藻體中色素含量的多少直接影響藻體的光合作用的能力[13]，同時Fe是藻類細胞光合色素合成不可缺少的元素，Fe3+添加量較低時，紫球藻活性物質的積累量少，這是因為Fe不足會影響細胞代謝活動中一些重要的酶的合成或降低其催化活性[1]。隨著Fe3+添加量的升高，紫球藻主要色素葉綠素a和胡蘿卜素的含量明顯增多，本試驗Fe3+最適濃度為5×10-5 mol/L。

藻膽蛋白是藍藻、紅藻和隱藻光合作用的捕光色素，主要包括藻紅蛋白、藻藍蛋白和別藻藍蛋白，其中藻紅蛋白是十分有開發前景的一員。紫球藻細胞內含有豐富的藻紅蛋白和藻藍蛋白，且以藻紅蛋白含量最多。紫球藻的生長環境會影響藻膽蛋白的含量，僅見少數報道[13-14]。在本試驗中，紫球藻的可溶性蛋白在培養的中后期開始明顯升高。王明茲等指出，隨著紫球藻生長周期中細胞濃度的升高，可見光在培養液中的穿透和擴散受到了影響，細胞僅由葉綠素吸收光能而不能滿足細胞代謝的需要，藻細胞在對數晚期開始積累代謝產物——藻膽蛋白[13]，這在一定程度上解釋了本試驗紫球藻可溶性蛋白含量在其對數生長期后期開始明顯升高的現象。本試驗中，有利于紫球藻水溶性蛋白積累的Fe3+濃度為 5×10-5 mol/L，這與劉丹楹等的結果[14]相似。在通入1%二氧化碳后，紫球藻的水溶性蛋白含量顯著降低，不過在補加氮源后，紫球藻水溶性蛋白含量明顯升高[11]。

紫球藻細胞外包圍著一層黏質鞘，即細胞分泌出來的水溶性黏多糖，該多糖是一類由葡萄糖、木糖和半乳糖等單糖組成的易溶于水的多聚體。它是1種磺酸化多糖，在抗病毒、抗腫瘤、抗血脂、抗菌等方面具有特殊的生物活性作用。紫球藻多糖的產量和提取效率低、制備成本高限制了該多糖的大規模開發應用[15]。因此，對不同生態條件下紫球藻多糖產量的研究具有十分重要的意義。盡管本試驗中4個Fe3+處理組的紫球藻胞外多糖產量與對照組之間不存在顯著差異，但其產量隨培養時間的延長和Fe3+濃度的升高而增大，說明Fe3+加富對紫球藻胞外多糖的分泌有著一定的促進作用。由于紫球藻胞外多糖通過高爾基體合成并分泌到胞外，因此其產量受到培養條件的明顯影響[16]。因此，篩選適宜的培養條件對獲取紫球藻胞外多糖具有重要的作用。韓娟等在培養紫球藻時通入1%的二氧化碳，可以顯著提高紫球藻的活性物質積累，其多糖含量最高可達238.8 mg/L，且在補加氮源后，其胞外多糖和水溶性蛋白的含量均顯著升高[11]。王明茲等指出，1 060 nm的激光照射可以使紫球藻多糖的分泌量提高 50%～150%[8]。此外，有研究表明，高鹽度對紫球藻胞外多糖的分泌具有一定的刺激作用，尤其在鹽度5%時，胞外多糖的分泌量顯著增大[17]，使藻細胞表面的外被增厚，有利于細胞形成表面的微環境，防治由于鹽度過高造成的細胞水分丟失，這是細胞防止離子毒害的機制之一[18]。

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