超聲波輔助的乙醇—硫酸銨雙水相聯合提取魚腥草總黃酮工藝

郝紅英+周芳+王改利

摘要：為了優化超聲波輔助的乙醇-硫酸銨雙水相聯合提取魚腥草總黃酮的工藝，通過單因素試驗優化影響總黃酮提取率的各因素水平，通過正交試驗確定各因素組合的影響程度。結果表明，各因素的影響排序為乙醇濃度>提取溫度>提取時間>料液比；最佳提取條件為脫脂魚腥草粉末2.0 g、乙醇用量32.50%（質量分數）、硫酸銨用量16.00%（質量分數）、料液比1 g ∶20 mL、超聲波頻率300 W、超聲波處理溫度70 ℃、超聲波處理時間50 min，在此條件下，魚腥草總黃酮提取率為2.97%。由結果可知，超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相聯合提取法提取效率高，操作簡便，是一種很有發展前途的提取方法。

關鍵詞：雙水相；魚腥草；總黃酮；提取工藝；正交設計；超聲波輔助提取

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2017）01-0183-03

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）是三白草科蕺菜屬多年生草本植物，營養豐富，具有多種藥理作用：抗菌、抗病毒、抗炎、抗過敏、抗腫瘤，此外，魚腥草還可以增強機體免疫功能[1-2]。魚腥草含有多種成分[3-4]，如揮發油、阿福豆苷、金絲桃苷及蕺菜堿等，其中黃酮類成分有斛皮素、斛皮苷、綠原酸、金絲桃苷等。目前關于魚腥草活性成分的提取尚無統一的方法，主要運用的提取方法有水煎煮法、醇提取法、索式抽提取法、超聲波提取法等[5]。超聲波能使植物組織細胞破裂，利于細胞中的成分進入溶劑中，加速細胞成分與溶劑的相互滲透和溶解，從而提高黃酮類化合物在溶劑中的溶解度[6]。超聲波提取法具有操作簡單、能耗低、可以縮短提取時間、可提高有效成分的提取率、減少溶劑的使用量、提取成本低等特點，因此，目前超聲波技術廣泛應用于植物有效成分的提取[7]。雙水相提取技術因設備投資少、操作簡單，引起了人們極大的重視，并且被廣泛用于生物化學、細胞生物學和生物化工等領域[8]，但是目前未見采用超聲波-雙水相聯合提取魚腥草總黃酮的報道。因此，本研究結合超聲波輔助提取法、雙水相萃取法2種方法的優點，采用超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相體系提取魚腥草中主要成分黃酮，以總黃酮得率為指標，采用單因素和正交試驗法，確定提取總黃酮有效成分的較佳工藝，旨在為魚腥草總黃酮提取工藝的產業化提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

魚腥草，購自當地藥店。蕓香苷標準樣品，由中國藥品生物制品檢定所提供，為生化試劑；其他試劑均為分析純。

超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；電熱恒溫水溫箱，北京市永光明醫療儀器廠；SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；7230G型可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 魚腥草中黃酮類化合物含量的測定參照文獻[9-10]的方法，以蕓香苷為標樣測定魚腥草總黃酮類化合物含量，所得標準曲線回歸方程為y=0.093 8x+0.000 1。式中：y為蕓香苷質量濃度，g/mL；x為吸光度；r2=0.999 8。

1.2.2 魚腥草總黃酮的提取與測定 魚腥草總黃酮的提?。悍Q取魚腥草干細粉（過60目篩）于索氏提取器中，經石油醚脫脂，并除去部分色素。稱取2.0 g處理樣品于250 mL碘量瓶中，按一定的料液比加入乙醇-硫酸銨雙水相溶液，置于超聲波清洗器中，提取一段時間后，過濾，靜置分層，將濾液用分液漏斗將兩相分開，將醇相提取液高速離心25 min，即得魚腥草總黃酮類化合物提取液，后經微孔濾膜過濾，精確稱取一定量用甲醇定容至250 mL，以供分析測試用。

魚腥草總黃酮的測定：取2.5 mL樣品溶液至25 mL容量瓶中，加1 mL 5% NaNO2（質量體積比，下同），搖勻，放置 5 min 后加入1 mL 10% Al（NO3）3（質量體積比，下同），5 min后再加入10 mL 4% NaOH（質量體積比，下同），搖勻，用蒸餾水稀釋至刻度，10 min后于7230G型可見分光光度計上在510 nm處測定吸光度D510 nm，根據蕓香苷標準曲線回歸方程，得到提取液濃度，總黃酮提取率按照下式計算：

Et=（C×V×D）/m×100%。

式中：Et為總黃酮提取率，%；C為測得的提取液濃度，g/mL；V為提取液體積，mL；D為稀釋倍數；m為原料的質量，g。

1.2.3 超聲波處理時間對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、恒定的乙醇用量32.50%（質量分數，下同）、超聲波處理溫度50 ℃、硫酸銨用量16.00%（質量分數，下同）的條件，稱取2.0 g處理樣品，選擇料液比 1 g ∶20 mL，研究不同超聲波處理時間（10、20、30、40 min）對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.2.4 料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、超聲波處理時間20 min、恒定的乙醇用量32.50%、超聲波處理溫度50 ℃、硫酸銨用量16.00%的條件，稱取 2.0 g 處理樣品，研究不同料液比（1 g ∶15 mL、1 g ∶20 mL、1 g ∶25 mL、1 g ∶30 mL）對魚腥草總黃酮提取率的影響。

1.2.5 超聲波處理溫度對魚腥草總黃酮提取率的影響 采用超聲波功率300 W、超聲波處理時間20 min、硫酸銨用量 16.00%、乙醇用量32.50%的條件，稱取2.0 g處理樣品，料液比選擇1 g ∶20 mL，研究不同超聲波處理溫度（30、40、50、60 ℃）對魚腥草總黃酮提取率的影響

1.2.6 正交試驗 在硫酸銨質量濃度、超聲波功率確定的情況下，以乙醇用量（體積分數）、超聲波提取溫度、料液比（m魚腥草 ∶V雙水相溶劑）、超聲提取時間為考察因素，設計L9（34）正交表（表1），并按照此正交表安排試驗，重復上述操作。

2 結果與分析

2.1 超聲波處理時間對魚腥草總黃酮提取率的影響

從圖1可以看出，總黃酮提取率在超聲波處理10～20 min 時逐漸增高，而后隨著處理時間的延長逐漸降低。其原因可能是超聲波處理時間越長，超聲波對魚腥草細胞壁組織的破壞程度就越大，更有利于黃酮類物質的釋放和進入溶液，但過長的超聲處理時間，可能會引起黃酮類化合物的破壞和氧化。因此綜合分析可知，乙醇-硫酸銨雙水相體系超聲提取魚腥草總黃酮的處理時間以20 min為宜。

2.2 料液比對魚腥草總黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，總黃酮提取率隨料液比的增大而提高，當料液比為1 g ∶20 mL時，提取率最高；隨著料液比的進一步增大，溶劑用量過大，會造成雙水相鹽用量增加，不僅耗費大量的溶劑和銨鹽，也會給后續處理帶來不必要的麻煩。

2.3 超聲提取溫度對魚腥草總黃酮提取率的影響

從圖3可以看出，隨著超聲提取溫度的升高，總黃酮提取率提高；當超聲溫度超過50 ℃時，提取率降低。超聲溫度低，導致黃酮不能完全溶出；而溫度過高，使超聲波破壞魚腥草細胞組織的能力增強，黃酮類物質更易浸出，但是在超聲波的作用下，過高的處理溫度會導致魚腥草黃酮類物質因氧化或被超聲波破壞等原因，使變質的量增加，同時溫度升高也會增加乙醇揮發量。因此由結果可以確定，50 ℃為魚腥草總黃酮提取的最佳溫度條件。

2.4 多因素正交試驗結果

在單因素考察的基礎上，為了得到更好的條件，進行正交試驗。選取3因素4水平，使用L9（34）正交設計（表1）來安排試驗，結果見表2、表3。

從表2、表3可知，各因素對提取率影響排序為乙醇用量>超聲提取溫度>超聲處理時間>料液比，其中乙醇濃度對魚腥草中總黃酮提取率的影響最大。由分析結果初步認為，超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相體系提取魚腥草總黃酮的最佳條件：在魚腥草質量為2.00 g的情況下，硫酸銨用量為 16.00%，乙醇用量32.50%，料液比1 g ∶20 mL，提取溫度 70 ℃，處理時間50 min。

2.5 平行試驗結果

為進一步驗證此正交試驗結果的可考性和重現性，按照所得最佳條件做了3次平行試驗，總黃酮提取率分別為 3.00%、2.97%、2.94%，均值為2.97%，RSD為0.03%。結果表明，使用正交試驗得出的方法，優化出了最佳提取工藝，提取率均值為2.97%，不但提取率較高，而且試驗的重現性好。

3 討論

通過單因素試驗、正交試驗法，優選出魚腥草總黃酮的雙水相最佳提取工藝：脫脂魚腥草粉末2.0 g，乙醇用量32.50%，硫酸銨用量16.00%，料液比1 g ∶20 mL，超聲波功率300 W，提取溫度70 ℃，處理時間50 min。在此條件下，魚腥草總黃酮提取率為2.97%。

超聲波-乙醇/硫酸銨雙水相聯合提取法是一種新型的液-液萃取技術，反應條件溫和，提取時間短，提取效率高，操作簡便，不存在有機殘留問題，是一種很有發展前景的聯合提取方法。

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